印雙紅， 張俊波

(1.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院，貴州銅仁 554300； 2.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院/銅仁市文化科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究中心，貴州銅仁 554300；3.浙江大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州 3100204)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，簡(jiǎn)稱Lm)是一種人畜共患的革蘭陽(yáng)性致病菌，同時(shí)也是四大食源性病原體之一?？稍诿庖吖δ艿拖碌膫€(gè)體中，如老年人、孕婦、新生兒等，引起腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重的感染性疾病，免疫力正常人群，在食入一定量Lm污染的食品后，也可能會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱性胃腸炎癥狀[1]。雖然該病的發(fā)病率不高，但是死亡率可高達(dá)20%～30%，危害很大，已成為全球性疾病，上世紀(jì)80年代歐美國(guó)家不斷發(fā)生單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的食物中毒事件，該病原菌才逐步受到人們的關(guān)注。單核細(xì)胞增生李斯特菌感染過(guò)程和致病機(jī)制成為研究的重點(diǎn)之一[2-3]，Lm是兼性細(xì)胞內(nèi)生存的病原菌，既能感染吞噬細(xì)胞也能感染非吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等，并在細(xì)胞中生長(zhǎng)、增殖進(jìn)而在細(xì)胞間進(jìn)行傳播[4]。其感染過(guò)程可以分為4個(gè)階段：入侵、逃逸吞噬泡、增殖以及在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播[5-6]。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素(Rapamycin)靶蛋白(mTOR)最早作為酵母雷帕霉素靶蛋白的同源體被發(fā)現(xiàn)，mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、凋亡、自噬以及細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞大小等方式，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝等方面發(fā)揮重要作用。近來(lái)mTOR作為免疫反應(yīng)的中心調(diào)控因子正在被關(guān)注，mTOR作為一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)的中央節(jié)點(diǎn)指導(dǎo)集成免疫微環(huán)境中的各種環(huán)境信號(hào)的輸入，調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、APC等各種免疫細(xì)胞的分化發(fā)育，影響其功能活性[7-8]。mTOR與許多疾病密切相關(guān)，然而與李斯特菌病關(guān)系如何，目前尚不清楚，本研究著重探討mTOR抑制劑對(duì)李斯特菌存活的影響，以期為揭示Lm致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Lm)和小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自GIBCO公司；酵母提取物、蛋白胨購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Triton X-100 細(xì)胞裂解液、MTT試劑盒和DMSO購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Caspase-1活性檢測(cè)試劑盒和雷帕霉素抑制劑購(gòu)自碧云天公司；小鼠IL-6、IFN-γ和IL-1βELISA試劑盒均購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司。

1.3 主要儀器

生物安全柜；超純水處理系統(tǒng)；CO2培養(yǎng)箱；低溫高速離心機(jī)；全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀，全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋。

1.4 MTT試驗(yàn)

(1)收集對(duì)數(shù)期的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積為200 μL，邊緣孔用無(wú)菌的PBS填充。

(2)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～24 h使細(xì)胞貼壁。

(3)將不同濃度的抑制劑雷帕霉素(5、10、20、50 nmol/L)與細(xì)胞共同孵育，0.1% DMSO處理的細(xì)胞作對(duì)照，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

(4)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。

(5)小心吸取上清，加入180 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入 20 μL MTT(5 mg/mL，即0.5% MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

(6)棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度。

(7)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO溶解液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO溶解液)，每組設(shè)定3復(fù)孔，細(xì)胞存活率=(D試驗(yàn)組-D空白組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100%。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

從NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站GenBank上查找公布相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系，實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞做3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)完成后用2-ΔΔCT法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)

1.6 Lm侵染小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

抑制劑雷帕霉素與小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用1 h，將30 μL的單克隆Lm接種到20 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。多次收集菌液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min 離心2 min；用PBS洗脫菌體3次，懸浮菌體，將其調(diào)整為5.0×107個(gè)/mL。以50 ∶1(細(xì)菌個(gè)數(shù) ∶細(xì)胞個(gè)數(shù))的比例，用Lm感染細(xì)胞，并將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在侵染1 h之后每孔用PBS洗滌3次，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子

小鼠ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作見(jiàn)操作步驟。抑制劑雷帕霉素(20 nmol/L)與小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用1 h，Lm感染細(xì)胞，將細(xì)菌 ∶細(xì)胞按50 ∶1的比例感染細(xì)胞，并將感染的細(xì)胞繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。僅用Lm感染的細(xì)胞作為對(duì)照組。在12 h和24 h收集細(xì)胞上清液，按照說(shuō)明書，完成IL-6、IFN-γ和IL-1β的ELISA檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷帕霉素對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

不同濃度抑制劑雷帕霉素(5、10、20、50 nmol/L)與細(xì)胞作用48 h后，收集細(xì)胞，利用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果表明，當(dāng)抑制劑雷帕霉素濃度為5、10、25 nmol/L不影響細(xì)胞活性(圖1)，而在50 nmol/L時(shí)細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，表明雷帕霉素對(duì)細(xì)胞活性影響具濃度依賴性。

2.2 雷帕霉素對(duì)Lm胞內(nèi)存活的影響

不同濃度(5、10、20 nmol/L)雷帕霉素與細(xì)胞孵育1 h，然后，將Lm感染細(xì)胞24 h，裂解細(xì)胞，通過(guò)菌斑計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)Lm數(shù)量隨著雷帕霉素濃度的增加而減少，Lm+雷帕霉素組細(xì)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；同一濃度雷帕霉素(20 nmol/L)與細(xì)胞孵育1 h，將Lm感染細(xì)胞4、12、24、48 h點(diǎn)，檢測(cè)胞內(nèi)菌數(shù)，結(jié)果顯示，在12、24、48 h時(shí)，雷帕霉素處理細(xì)胞中Lm的lgCFU值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而在 4 h 與對(duì)照組無(wú)顯著差異(圖2)，表明雷帕霉素抑制胞內(nèi)菌數(shù)與其濃度和感染時(shí)間相關(guān)。

2.3 雷帕霉素對(duì)Lm介導(dǎo)細(xì)胞因子水平的影響

雷帕霉素與細(xì)胞作用1 h，然后，用Lm感染細(xì)胞，未經(jīng)雷帕霉素處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，分別在12 h和24 h收集細(xì)胞上清液，利用ELISA檢測(cè)IL-6和IFN-γ水平，結(jié)果顯示，雷帕霉素處理組誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6和IFN-γ水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明，雷帕霉素誘導(dǎo)Lm介導(dǎo)IL-6和IFN-γ水平，從而提高抵抗Lm感染的細(xì)胞免疫(圖3)。

2.4 雷帕霉素對(duì)Lm介導(dǎo)caspase-1水平的影響

本研究先用雷帕霉素與細(xì)胞孵育1 h，然后，用Lm感染細(xì)胞12 h和24 h，用試劑盒檢測(cè)caspase-1活性。結(jié)果顯示，Lm+雷帕霉素組細(xì)胞caspase-1的D405 nm值都極顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.01)，結(jié)果表明，雷帕霉素可提高Lm介導(dǎo)的caspase-1活性，從而誘導(dǎo)Lm介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖4)。

2.5 雷帕霉素對(duì)Lm介導(dǎo)細(xì)胞炎性體的影響

為進(jìn)一步證實(shí)Lm是否能夠激活該細(xì)胞的炎性體，并檢測(cè)雷帕霉素對(duì)Lm介導(dǎo)細(xì)胞炎性體的影響，本研究先用雷帕霉素與細(xì)胞孵育1 h，然后，用Lm感染細(xì)胞24 h，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β的含量，用qRT-PCR檢測(cè)NLRP3的mRNA相對(duì)水平變化。結(jié)果(圖5)顯示，Lm組的IL-1β水平和NLRP3的mRNA水平顯著高于對(duì)照組Control正常細(xì)胞(P<0.01)，并且，Lm+雷帕霉素組細(xì)胞IL-1β水平和NLRP3的mRNA水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.01)，結(jié)果表明，Lm能夠激活該細(xì)胞的炎性體，雷帕霉素可增強(qiáng)Lm介導(dǎo)的細(xì)胞炎性體水平。

3 討論

mTOR在調(diào)節(jié)帽依賴的翻譯起始中扮演重要角色，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成作用而成為細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中的重要調(diào)節(jié)器。mTORC1通過(guò)生長(zhǎng)因子、能量水平氨基酸來(lái)調(diào)控生長(zhǎng)，它的活性在許多疾病中都被下調(diào)[9]。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體通過(guò)調(diào)控Rheb-GTP的水平變化向mTORC1傳遞生長(zhǎng)因子和能量信號(hào)[9]。當(dāng)TSC失活，Rheb-GTP的水平增高，使mTORC1抑制劑FKBP38離開(kāi)mTORC1[10]，導(dǎo)致mTORCl活化，從而保證帽依賴翻譯，維持正常細(xì)胞周期進(jìn)程。但最近有研究報(bào)道，在哺乳動(dòng)物中，mTORC1通過(guò)其下游效應(yīng)器4EBP1調(diào)控細(xì)胞增殖而非細(xì)胞生長(zhǎng)，而在低等真核生物中，兩者可同時(shí)被調(diào)控[11]。也有研究指出，mTORC1通過(guò)感受能量因子活化的關(guān)鍵是磷脂酶D介導(dǎo)產(chǎn)生的磷脂酸而非TSC[12]。相比mTORC1，mTORC2的功能則研究較少。Jacinto等報(bào)道，mTORC2可調(diào)控細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的形成[13]。Akt有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)：serine473和threonine308[14]，其中serine473是mTORC2唯一的底物。mTORC2通過(guò)serine473磷酸化Akt，從而活化mTORC1來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13]，故mTORC2可認(rèn)為是mTORC1的上游信號(hào)分子。

細(xì)胞免疫是胞內(nèi)菌感染的有效免疫形式。Lm的天然免疫應(yīng)答涉及各種細(xì)胞和細(xì)胞因子及其之間的相互作用。研究表明，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及髓樣DC中的PI3K-mTOR通路對(duì)TLR信號(hào)是至關(guān)重要的[15]。在對(duì)體外培養(yǎng)的老鼠DC研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR后可以抑制全部的炎癥反應(yīng)。然而在剛分離的人單核細(xì)胞和初始mDC內(nèi)，刺激TLR不改變TSC-mTOR通路下游的PI3K對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。雷帕霉素處理后的炎癥反應(yīng)受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT3調(diào)控。在人單核細(xì)胞中，抑制mTOR會(huì)提高經(jīng)由NF-κB的炎性細(xì)胞因子 IL-12p40、IL-12p70、IL-23、IL-6以及TNF-α的生成，但是會(huì)阻斷通過(guò)STAT3的IL-10的釋放。研究顯示，NF-κB和STAT3是受mTOR獨(dú)立調(diào)控。在炎癥反應(yīng)調(diào)控相類似的活體試驗(yàn)中，抑制mTOR后通過(guò)提高IL-12的生成可以保護(hù)老鼠抵抗Lm的致命感染。雷帕霉素處理處在TLR興奮期的單核細(xì)胞和DC，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的激活，促進(jìn)IFN-γ、IL-17的生成[16]。在感染初期，其中IL-1、IL-6、TNF-α和 IFN-γ在抗Lm過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究表明，PI3K抑制劑雷帕霉素可以提高胞內(nèi)Lm介導(dǎo)的IL-6和IFN-γ的分泌，有助于細(xì)胞抵抗Lm的感染，因此，揭示了PI3K抑制劑雷帕霉素調(diào)控Lm存活的分子機(jī)制。

靶細(xì)胞表面的死亡受體通過(guò)與配體結(jié)合，可進(jìn)一步激活FADD進(jìn)而激活下游的caspase-8或caspase-10，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。報(bào)道還表明，mTOR通路在TRAIL介導(dǎo)產(chǎn)生的多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。Liu等報(bào)道m(xù)TOR抑制劑雷帕霉素通過(guò)抑制Na/K-ATPase活性可以直接活化TNFa誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生后的Caspase-9的活性，從而加速細(xì)胞凋亡[18]。Barbone等[19]報(bào)道在實(shí)體瘤細(xì)胞中，mTOR及其下游信號(hào)分子S6K基因敲除后可以顯著提高TRAIL介導(dǎo)產(chǎn)生的活化caspase-8，證明了mTOR通路通過(guò)調(diào)控死亡受體通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，可以看出，mTOR信號(hào)通路可以直接或間接作用于死亡受體或相應(yīng)配體，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但根據(jù)細(xì)胞類型的不同，其作用機(jī)制也不一樣。

炎性體的活化在病原感染過(guò)程中受到嚴(yán)密調(diào)控，過(guò)度的活化會(huì)造成大量的細(xì)胞死亡和組織損傷。炎性體的活化需要第一信號(hào)和第二信號(hào)共同調(diào)節(jié)[20-21]，炎性體通過(guò)第一信號(hào)，上調(diào)炎性體各成員基因以及IL-1β前體的轉(zhuǎn)錄；通過(guò)第二信號(hào)炎性體各個(gè)成員裝配形成多蛋白復(fù)合物。炎性體活化后主要促進(jìn)IL-1β、IL-18等促炎癥細(xì)胞因子的分泌和介導(dǎo)caspase-1依賴的細(xì)胞死亡“pyroptosis”，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)，抵抗并清除入侵的病原微生物。IL-1β能激活T細(xì)胞介導(dǎo)的Th1、Th17細(xì)胞免疫以及B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫等適應(yīng)性免疫[22]。許多胞內(nèi)寄生菌的毒力因子被NLPR 1、NLRP3等胞內(nèi)PRRs所識(shí)別，介導(dǎo)相應(yīng)的炎性體活化。在Lm感染引起的NLRP3炎性體活化的過(guò)程中，鳥苷酸結(jié)合蛋白5能促進(jìn)ASC的寡聚化，從而促進(jìn)炎性體的形成。炎性體活化后，促炎細(xì)胞因子IL-1β的成熟和分泌能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，這對(duì)于抵抗入侵的病原都具有重要意義[23]。目前Lm主要能活化單核巨噬細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的NLRP3炎性體[24]、AIM2炎性體以及NLRC4炎性體，而在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上，Lm能活化的炎性體形式尚未見(jiàn)報(bào)道，結(jié)果顯示，Lm能活化腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性體，并且，抑制劑雷帕霉素可調(diào)控Lm介導(dǎo)的細(xì)胞炎性體水平。

本研究發(fā)現(xiàn)抑制劑雷帕霉素可顯著降低Lm在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的存活，由于mTOR信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，因此，推測(cè)雷帕霉素主要通過(guò)mTOR信號(hào)通路調(diào)控Lm介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控了Lm在細(xì)胞內(nèi)的存活，研究表明雷帕霉素在調(diào)控Lm胞內(nèi)的生存繁殖發(fā)揮重要作用，為揭示Lm致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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