王奕鐸，凌志新，陳明,2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 南京 210009)

尿路上皮細(xì)胞癌是膀胱癌最主要的組成部分。在我國，膀胱癌發(fā)病率位居男性惡性腫瘤第6位。2015年，我國預(yù)期新診斷膀胱癌約80.5萬例，死亡人數(shù)約32.9萬。目前膀胱癌的治療方式主要為手術(shù)治療及化療為主的輔助治療[1]。2010年以來，隨著順鉑類藥物為基礎(chǔ)的新輔助化療在美國的普及以及各種分子靶向藥物的應(yīng)用，膀胱癌患者的總體生存期較前有所提高[2]。目前膀胱癌的研究方向之一為探索膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、分型的機(jī)制以及其中關(guān)鍵的驅(qū)動因子，為“精準(zhǔn)治療”提供依據(jù)[3-4]。

根據(jù)美國腫瘤研究機(jī)構(gòu)(TCGA)對膀胱癌組織的基因測序結(jié)果，編碼組蛋白修飾及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基因突變率高達(dá)89%[5]。研究證明表觀遺傳學(xué)改變在膀胱癌發(fā)生過程中起了重要的作用[6]。EZH2是表觀遺傳學(xué)中重要的調(diào)控因子，其編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)，作用為催化組蛋白H3賴氨酸K27(H3K27)甲基化。EZH2抑制劑GSK126可以有效抑制HMT活性，阻礙H3K27甲基化，降低H3K27m3[7-9]。目前GSK126正在進(jìn)行 Ⅰ 期藥物臨床試驗用于治療淋巴瘤及骨髓瘤[10]。本研究采用膀胱癌細(xì)胞株及小鼠膀胱癌模型，探索EZH2抑制劑GSK126對膀胱癌活性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物及細(xì)胞株

UM-UC9膀胱癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。用含10%胎牛血清和終濃度為100 μg·ml-1青霉素及50 μg·ml-1鏈霉素雙抗的EMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況用0.25%胰蛋白酶每周傳代2次。當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定并進(jìn)入對數(shù)生長期時開始用于實驗。GSK126購自Sigma公司，細(xì)胞株傳代24 h后以終濃度5 μmol·L-1直接溶于培養(yǎng)基中，每次細(xì)胞傳代、換液均加入GSK126，維持7 d后收獲細(xì)胞。

1.2 RT-PCR

GSK126治療UM-UC9 7 d后將細(xì)胞低溫充分勻漿，用試劑盒抽提RNA并分別逆轉(zhuǎn)錄，在ABI7300定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，計算各目標(biāo)mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 蛋白質(zhì)印跡實驗

提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，加入6倍上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min變性，冷卻備用。取蛋白樣品50 μg左右和DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)試劑5 μl上樣，80 V 40 min、120 V 120 min電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉，一抗孵育過夜，洗膜30 min，二抗孵育60 min，洗膜30 min，曝光。

1.4 免疫組化

切片于二甲苯中脫蠟，乙醇梯度水化處理，采用高壓加熱抗原修復(fù)法充分暴露抗原位點；待其自然冷卻后PBS洗滌，滴加兔抗人YY1一抗，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌，滴加二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌，鏡下控制DAB顯色5～10 min；終止顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇固定，封片，觀察。免疫組化結(jié)果以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞標(biāo)志，采用雙盲法，計數(shù)10個高倍(400倍)視野，計算陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率。

1.5 小鼠膀胱癌模型建立

野生型C57/B6小鼠16只，分為EZH2抑制劑GSK126治療組(簡稱治療組)和對照組各8只。N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝基胺(BBN)購自日本TCI株式會社。0.05% BBN溶于水中供小鼠飲用，持續(xù)5個月，期間小鼠不得飲用其他水源。10 mg·kg-1GSK126灌胃每天1次，持續(xù)24 d。處死小鼠，取出膀胱，腫瘤組織測量大小、質(zhì)量后固定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間評分比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSK126對膀胱癌細(xì)胞活性的影響

UM-UC9膀胱癌細(xì)胞株穩(wěn)定增殖后，予含GSK126 5 μmol·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞活性實驗及細(xì)胞克隆實驗顯示GSK126抑制了UM-UC9的活性(圖1A、B)。GSK126治療7 d后，分別提取治療組和對照組蛋白以及RNA，檢測Ki67的表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡以及RT-PCR顯示，治療組Ki67的表達(dá)量降低(圖1C、D)。以上實驗驗證GSK126抑制了UM-UC9的活性。

圖1EZH2抑制劑GSK126對UMUC9膀胱癌細(xì)胞株活性的影響A、B.細(xì)胞活性實驗顯示GSK126抑制UM-UC9膀胱癌細(xì)胞生長； C、D.蛋白質(zhì)免疫印跡和RT-PCR顯示GSK126抑制了Ki67表達(dá)

隨后，我們通過小鼠膀胱癌模型驗證GSK126對膀胱癌細(xì)胞活性的影響。首先我們給小鼠0.05%BBN溶液飲用5個月誘導(dǎo)B6小鼠產(chǎn)生膀胱癌(如圖2B，圖2A為飲用正常水5個月后的膀胱)。隨后予GSK126灌胃24 d(10 mg·kg-1，每日1次)，比較治療組(圖2C)與對照組(圖2D)小鼠膀胱癌質(zhì)量。結(jié)果，相對于對照組，治療組膀胱癌的質(zhì)量較輕，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.11，圖3)。

圖2小鼠膀胱癌模型建立后予GSK126治療膀胱癌
A.小鼠飲用正常水5個月后的膀胱； B.小鼠飲用0.05%BBN 5個月后誘導(dǎo)出膀胱癌； C.患膀胱癌小鼠GSK126治療后膀胱； D.患膀胱癌小鼠安慰劑治療組膀胱

圖3GSK126治療膀胱癌小鼠降低了膀胱癌腫瘤組織質(zhì)量

對小鼠膀胱癌組織行免疫組化顯示，GSK126有效抑制了膀胱癌細(xì)胞H3K27甲基化。治療組H3K27m3的表達(dá)量(圖4B)較對照組(圖4A)低。

2.2 GSK126對膀胱癌細(xì)胞上皮間質(zhì)性轉(zhuǎn)變的影響

腫瘤上皮間質(zhì)性轉(zhuǎn)變通常影響腫瘤的浸潤及侵襲。對GSK126治療組及對照組小鼠膀胱癌組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，GSK126可以影響小鼠膀胱癌的浸潤侵襲能力。病理檢查提示：對照組膀胱癌細(xì)胞突破膀胱黏膜基層，顯示了較強(qiáng)的浸潤侵襲能力(圖4C)；GSK126治療組膀胱癌細(xì)胞主要局限于膀胱黏膜層，未突破基層(圖4D)。

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法和RT-PCR檢測UM-UC9上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記蛋白的表達(dá)量，結(jié)果(圖5A、B)顯示，較之對照組，GSK126治療后的UM-UC9膀胱癌細(xì)胞株CDH1與UPK3KA表達(dá)量升高，CDH2與ZEB1的表達(dá)量降低。提示EZH2抑制劑GSK126通過抑制膀胱癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變減弱其浸潤侵襲能力。

圖4小鼠膀胱癌GSK126治療后膀胱組織行免疫組化
A.對照組小鼠膀胱癌組織H3K27m3免疫組化顯示多數(shù)腫瘤細(xì)胞核深染，H3K27m3表達(dá)量高 免疫組化SP染色×400； B.治療組小鼠膀胱癌組織H3K27m3免疫組化顯示多數(shù)腫瘤細(xì)胞核染色較淺，H3K27m3表達(dá)量較對照組低 免疫組化SP染色×400； C.小鼠喂食BBN 5個月，HE染色顯示小鼠膀胱癌組織惡性程度較高，浸潤至肌層 HE染色×100； D.小鼠喂食BBN 3個月，HE染色顯示小鼠膀胱癌組織惡性程度低，未浸潤至黏膜下層 HE染色×100

圖5GSK126對膀胱癌細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響A、B.蛋白質(zhì)免疫印跡和RT-PCR顯示GSK126提升了CDH1、UPK3KA表達(dá)，降低了CDH2、ZEB1和H3K27m3表達(dá)

3 討 論

EZH2作為組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶在轉(zhuǎn)錄過程中起到重要作用。其通過抑制轉(zhuǎn)錄影響多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。各項研究都顯示了EZH2表達(dá)量在乳腺癌、肺癌以及膀胱癌中升高[11]。同時通過TCGA數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)，膀胱癌癌組織中高表達(dá)EZH2的患者通常預(yù)后不佳。相對于低表達(dá)EZH2的患者，高表達(dá)EZH2的患者總體生存期及無腫瘤生存期較短。以上研究證實了EZH2為惡性腫瘤潛在的治療靶點[12]。EZH2抑制劑GSK126可以抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，抑制組蛋白H3K27甲基化，從而起到增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。本研究采用膀胱癌細(xì)胞株及小鼠膀胱癌模型檢測其對膀胱癌細(xì)胞的影響。

我們首先通過體外實驗檢測GSK126對膀胱癌細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是體外及體內(nèi)實驗，GSK126均能較強(qiáng)地抑制組蛋白H3K27甲基化，降低腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織中H3K27m3的表達(dá)量。通過細(xì)胞活性實驗，我們證實了GSK126可以顯著降低膀胱癌細(xì)胞活性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。為證實GSK126抑制腫瘤活性能力在體內(nèi)同樣有效，我們構(gòu)建小鼠膀胱癌模型，誘導(dǎo)膀胱癌成功后，予小鼠灌胃GSK126模擬EZH2靶向治療。通過測量小鼠膀胱腫瘤質(zhì)量我們發(fā)現(xiàn)，GSK126治療組膀胱癌腫瘤質(zhì)量較輕，考慮全身應(yīng)用GSK126也能起到抑制膀胱癌細(xì)胞增殖能力的作用。但實驗結(jié)果未發(fā)現(xiàn)較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，主要原因我們考慮為樣本量較少。

我們同時也通過體內(nèi)及體外實驗驗證GSK126對膀胱癌細(xì)胞浸潤侵襲能力的影響。觀察小鼠膀胱癌組織病理切片發(fā)現(xiàn)：對照組的膀胱癌組織惡性程度較高，發(fā)生了膀胱肌層浸潤；GSK126治療組腫瘤惡性程度較低，腫瘤組織局限在膀胱黏膜層，浸潤和侵襲能力較弱。腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)性轉(zhuǎn)變(EMT)也可以反映其浸潤和侵襲能力。我們檢測了UM-UC9各種EMT標(biāo)記蛋白，發(fā)現(xiàn)GSK126可以升高CDH1、UPK3KA的表達(dá)量，降低CDH2、ZEB1的表達(dá)量，提示GSK126在體外實驗中降低了膀胱癌細(xì)胞的浸潤和侵襲能力。

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