張旭

(內(nèi)江市第一人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 內(nèi)江 641000)

化療是目前治療胃癌的重要手段之一，其可抑制胃癌細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移，殺死殘存的胃癌細(xì)胞，進(jìn)而降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；但是胃癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)卻是影響化療效果的主要因素，其可導(dǎo)致多藥聯(lián)合化療的總有效率下降50%左右，嚴(yán)重影響預(yù)后[1-2]。因此，研究胃癌細(xì)胞MDR的機(jī)制并從中尋找逆轉(zhuǎn)的辦法進(jìn)而提高化療效果，已成為目前廣大醫(yī)師關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。有研究[3]表明，鋅指蛋白139(ZNF139)、多藥耐藥基因1(MDR1)及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)mRNA均在胃癌細(xì)胞MDR過程中發(fā)揮著重要作用，而粉防己堿(TET)不但具有良好的抗腫瘤效果，還對多種腫瘤的MDR均有明顯的逆轉(zhuǎn)作用[4]。為此，本研究對胃癌細(xì)胞SGC7901以及胃癌耐阿霉素細(xì)胞SGC7901/ADR經(jīng)TET處理前后的ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測分析，旨在為探討TET對胃癌MDR的作用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC7901和胃癌耐阿霉素(ADR)細(xì)胞株SGC7901/ADR均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2 試劑與儀器

胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，Trizol提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測試劑盒均購自美國Promega公司，TET購自美國Sigma公司，PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)(型號為7900FS)，恒溫培養(yǎng)箱為北京永光明儀器公司生產(chǎn),GIS圖像處理系統(tǒng)由上海天能科技公司提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

利用含10%新胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC79O1細(xì)胞，以含0.4 mg·L-1ADR的培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC7901/ADR細(xì)胞，以維持其耐藥表型。

取對數(shù)期生長的GC7901和SGC7901/ADR部分細(xì)胞，利用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為8×104ml-1的單細(xì)胞懸液，再各取100l接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。取部分SGC7901/ADR細(xì)胞懸液，吸出培養(yǎng)液后再加入含2.0g·ml-1TET的培養(yǎng)基[5]，每孔終體積100l，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 RT-PCR檢測

分別收集SGC7901、SGC 7901/ADR和經(jīng)TET處理后的細(xì)胞懸液，利用Trizol試劑盒提取組織RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用RT-PCR檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測ZNF139、MDR1、GST-π基因的mRNA表達(dá)水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 蛋白印跡法檢測

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩種細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)

SGC7901/ADR細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA相對表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞(P<0.05)，見表1；SGC7901/ADR細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π蛋白相對表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞(P<0.05)，見表2。

細(xì) 胞mRNA相對表達(dá)量ZNF139MDR1GST-πSGC79010.421±0.0840.408±0.0910.387±0.090SGC7901/ADR1.011±0.1230.972±0.0830.980±0.086t值-12.526-14.481-15.064P值<0.05<0.05<0.05

細(xì) 胞蛋白相對表達(dá)量ZNF139MDR1GST-πSGC79010.394±0.0640.408±0.0710.410±0.082SGC7901/ADR0.722±0.0961.104±0.1010.972±0.103t值-8.99-17.827-13.499P值<0.05<0.05<0.05

2.2 TET處理前后SGC7901/ADR細(xì)胞表達(dá)情況

TET處理后，SGC7901/ADR細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA相對表達(dá)量均較處理前明顯降低(P<0.05，表3)，SGC7901/ADR細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π蛋白相對表達(dá)量也明顯低于處理前(P<0.05，表4)。

3 討 論

3.1 研究背景

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，目前臨床上多采用化療方式治療，雖然能取得一定的效果，但長期應(yīng)用藥物導(dǎo)致的MDR性會(huì)影響化療的效果，進(jìn)而影響預(yù)后[6]。MDR是臨床上常見的耐藥方式，主要是指腫瘤對化療藥物的適應(yīng)性改變，尤其是對其他抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，從而嚴(yán)重影響化療的效果[7-8]。研究[9]表明，針對MDR的腫瘤細(xì)胞，一味地增加藥物劑量非但不能提高療效,還可能會(huì)產(chǎn)生更大的毒副作用。目前臨床上仍沒有能有效逆轉(zhuǎn)MDR的藥物，而研究MDR的發(fā)作機(jī)制并尋求逆轉(zhuǎn)的藥物已成為目前腫瘤化療研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

時(shí) 間mRNA相對表達(dá)量ZNF139MDR1GST-π處理前1.011±0.1230.972±0.0830.980±0.086處理后0.124±0.0640.194±0.0620.187±0.070t值20.2323.74822.615P值<0.05<0.05<0.05

時(shí) 間蛋白相對表達(dá)量ZNF139MDR1GST-π處理前0.722±0.0961.104±0.1010.972±0.103處理后0.106±0.0110.411±0.0810.604±0.075t值20.15916.9279.133P值<0.05<0.05<0.05

3.2 ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)與MDR的關(guān)系

研究[10-11]表明，MDR的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，一般認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果，目前已確定的發(fā)生機(jī)制主要包括與耐藥相關(guān)的一些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如P170糖蛋白(P-gp)、鋅指蛋白139(ZNF139)、多藥耐藥相關(guān)蛋白-1(MDR-1)等的高表達(dá)以及與細(xì)胞質(zhì)/核有關(guān)的因素如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)、凋亡抑制等，而腫瘤細(xì)胞某些生化特征改變等都與耐藥性產(chǎn)生機(jī)制有關(guān)。研究[11]表明，ZNF蛋白含有特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，參與了腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及MDR過程；而MDR-1是MDR相關(guān)蛋白的重要成員之一，其也被認(rèn)為是MDR機(jī)制中最重要的機(jī)制之一[12]。GST-π是GST的亞型之一，在許多腫瘤組織和細(xì)胞中過度表達(dá)，并能調(diào)節(jié)信號途徑，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，也被認(rèn)為是腫瘤化療產(chǎn)生耐藥性的主要因素之一[13]。本研究通過對胃癌細(xì)胞SGC7901以及胃癌細(xì)胞SGC7901/ADR的ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，SGC7901/ADR細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白相對表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞(P<0.05)，提示ZNF139、MDR1、GST-π基因均與MDR的機(jī)制有密切關(guān)系，其相關(guān)蛋白的高度表達(dá)可能參與了MDR的發(fā)生和發(fā)展過程。

3.3 TET對胃癌細(xì)胞MDR的影響

TET是目前研究認(rèn)為具有MDR逆轉(zhuǎn)作用的新藥之一，主要從中藥粉防己的根塊中提取得到，活性成分為雙芐基異喹啉類生物堿。研究[14-15]表明，TET不但具有良好的抗腫瘤作用，還對多種腫瘤的MDR有一定的逆轉(zhuǎn)作用，但其具體機(jī)制目前尚不完全清楚，一般認(rèn)為TET能激活內(nèi)源性凋亡途徑并抑制Erkl/2和Aktl/2通路，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)MDR。

本研究對胃癌耐ADR細(xì)胞SGC7901/ADR加入了2.0g·ml-1TET進(jìn)行處理，并對處理前后的ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測分析，結(jié)果表明，TET處理后SGC7901/ADR細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白相對表達(dá)量明顯低于處理前(P<0.05)，提示TET能明顯下調(diào)胃癌耐藥細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而在逆轉(zhuǎn)胃癌MDR特性方面發(fā)揮著重要作用。但本研究限于研究樣本的不足，對TET下調(diào)ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)水平的機(jī)制以及能否將TET作為逆轉(zhuǎn)胃癌MDR的藥物尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，TET能下調(diào)胃癌耐藥細(xì)胞ZNF139、MDR1、GST-π mRNA及蛋白表達(dá)水平，從而在逆轉(zhuǎn)胃癌MDR特性方面發(fā)揮重要作用。

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