李炳乾，張桂龍，余勇波，陳陸馗

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 神經(jīng)外科, 江蘇 南京 210009)

腦卒中是一種以高發(fā)病率、高致死率、高致殘率為特點(diǎn)且對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重危害的疾病[1]，其中80%為缺血性腦卒中。缺血性腦卒中發(fā)生早期快速再灌注是重要的治療策略，但會(huì)引起再灌注損傷，與其相關(guān)的急性炎癥反應(yīng)促進(jìn)繼發(fā)性腦損害[2]。過(guò)度的炎癥反應(yīng)是造成缺血區(qū)再灌注損傷的重要因素之一，參與炎癥反應(yīng)的炎癥細(xì)胞及炎癥因子起到了主要的作用。1992年Reynolds與Weiss首次提出神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)這一概念，研究并發(fā)現(xiàn)其具有自我更新及分化3個(gè)神經(jīng)譜系的能力[3-4]。本研究向大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型(MCAO/R模型)大鼠立體定向注入NSCs，擬通過(guò)觀察大鼠腦脊液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素10(IL-10)含量的變化，以探討NSCs對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 NSCs的提取、培養(yǎng)

取1只孕14 d的SD大鼠，脫頸處死，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡5 min消毒，取出胎鼠，取胚胎的海馬組織，用眼科剪剪碎后反復(fù)吹打，然后加胰酶消化8～10 min，離心后加入培養(yǎng)基，接種至培養(yǎng)瓶，用無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM/F12、2%B27、EGF 20 ng·ml-1、bFGF 20 ng·ml-1、1%雙抗)培養(yǎng)，3～4 d換液1次，6～7 d傳代1次。

1.2 NSCs鑒定及分化后的鑒定

先用多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)皿，將懸浮培養(yǎng)后的神經(jīng)球消化吹打成單個(gè)細(xì)胞后接種在此培養(yǎng)皿中，用分化培養(yǎng)基(DMEM/F12、10%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)2 d，然后進(jìn)行免疫染色。

按上述培養(yǎng)5 d后移去培養(yǎng)液，用0.01 mol·L-1的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，再重新加入分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后在室溫下封閉1 h，分別加入一抗Nestin(1∶200)、Tuj1(1∶1 000)、GFAP(1∶1 000)、MOG(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，然后分別加入相應(yīng)FITC及Cy3偶聯(lián)的二抗(1∶400)，室溫孵育1 h，再分別加入DAPI(0.5 μg·ml-1)10 min，用0.01 mol·L-1的無(wú)菌PBS洗滌3次后用熒光封片劑封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及MCAO/R模型的制作

采用改良Longa法制作MCAO/R模型。建立MCAO/R模型3 d后進(jìn)行NSCs移植。取96只雄性SD大鼠，體重240～260 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組。假手術(shù)組步驟同手術(shù)組，但不插入栓線，對(duì)模型組術(shù)后用Zea Longa評(píng)分法[5]評(píng)分，將得分1～3分的大鼠隨機(jī)分為為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，加上假手術(shù)組最后得到3組老鼠，每組32只。

1.4 細(xì)胞移植

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的立體定向細(xì)胞移植法[6]，目前尚未發(fā)現(xiàn)此方法有加重神經(jīng)損傷的可能。2016文獻(xiàn)[7]的NSCs臨床試驗(yàn)也是通過(guò)立體定向進(jìn)行細(xì)胞移植。將懸浮培養(yǎng)的第5代NSCs離心5 min(1 000 r·min-1)，加入少量PBS后將細(xì)胞球輕輕吹打成單細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至1×105μl-1。

實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物于術(shù)后3 d在腦立體定位儀定位下于前囟左側(cè)3.5 mm、前0.5 mm、深4.5 mm處用微量進(jìn)樣器注入10 μl細(xì)胞；對(duì)照組注入等量濃度0.01 mol·L-1的PBS；假手術(shù)組不作處理。

1.5 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

分別對(duì)各組大鼠在術(shù)后1、3、14、28 d 4個(gè)不同時(shí)間段采用改良大鼠神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評(píng)分量表(m-NSS)[8]分別從運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)功能、平衡能力及生理反射進(jìn)行評(píng)分，正常記0分，總計(jì)18分，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重者得分越高。

1.6 大鼠腦脊液及腦組織的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)

將大鼠用10%的水合氯醛麻醉后，用1 ml空針從枕大池處抽取約0.1 ml清亮腦脊液，將所取的腦脊液放在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；按照ELISA試劑盒(購(gòu)自上海信帆生物科技)說(shuō)明書(shū)測(cè)定所得腦脊液中的TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)結(jié)果均用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖由Prism 5繪制。

2 結(jié) 果

2.1 NSCs培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

提取出的NSCs在裝有無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察到NSCs呈球形懸浮生長(zhǎng)，且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)所形成的球越大。巢蛋白(nestin，屬中間絲蛋白)是NSCs的標(biāo)志性蛋白。將培養(yǎng)至第3代的NSCs行巢蛋白免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果神經(jīng)球有明顯的熒光顯示(圖1)。

2.2 NSCs分化為神經(jīng)元的鑒定結(jié)果

將培養(yǎng)瓶中已培養(yǎng)14 d的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至16孔平板上，撤出生長(zhǎng)因子，并加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后子代NSCs可分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞。將分化后的細(xì)胞行TUJ1、MOG、GFAP免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果，由NSCs分化來(lái)的神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的熒光顯示(圖2)。

2.3 神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評(píng)分結(jié)果

假手術(shù)組的評(píng)分均為0分，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的評(píng)分隨著時(shí)間的推移均呈下降趨勢(shì)，但是從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看實(shí)驗(yàn)組評(píng)分下降得更早、趨勢(shì)更大，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示實(shí)驗(yàn)組移植的NSCs對(duì)模型大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)有明顯的促進(jìn)作用(圖3)。

2.4 ELISA檢測(cè)結(jié)果

各組腦脊液中TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1含量在不同時(shí)間段的比較：假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間段的含量沒(méi)有明顯變化。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組在早期炎癥因子含量都比假手術(shù)組要高，隨著時(shí)間的推移其含量逐漸降低，到28 d時(shí)與假手術(shù)組持平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中實(shí)驗(yàn)組腦脊液中TNF-α、IL-1β含量在1、3、14 d都低于對(duì)照組，IL-10、TGF-β1含量在1、3、14 d都高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討 論

缺血性腦卒中是臨床上常見(jiàn)的對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成永久性損傷的嚴(yán)重疾病。早期恢復(fù)缺血區(qū)血供有助于減少腦損傷，但其可能導(dǎo)致的缺血再灌注損傷會(huì)造成二次損傷。炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元的遲發(fā)性壞死、神經(jīng)功能障礙等的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子水平與腦損傷程度有較大關(guān)系[9]，所以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)成為抑制神經(jīng)元凋亡的有效手段，故本研究選取4個(gè)經(jīng)典的炎癥因子(TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1)作為研究對(duì)象，以期通過(guò)檢測(cè)腦脊液中炎癥因子的含量來(lái)衡量顱內(nèi)炎癥反應(yīng)情況。IL-1β和TNF-α都是促炎因子，是腦缺血后促發(fā)顱內(nèi)炎癥反應(yīng)的較重要的因子[10-11]。IL-1β主要通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放相關(guān)炎性物質(zhì)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，從而加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷[12-13]。TNF-α可以通過(guò)釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用；激活巨噬細(xì)胞，促使炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，造成神經(jīng)功能損傷[14-15]。TGF-β1和IL-10均是由調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg細(xì)胞)分泌的抗炎因子，可抑制T細(xì)胞應(yīng)答和保持免疫耐受[16]。在腦缺血再灌注損傷中，TGF-β1可起到防止過(guò)度炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減輕腦缺血再灌注損傷的作用。IL-10能抑制TNF-α和干擾素-γ(IFN-γ)的神經(jīng)毒性作用[17]，減少神經(jīng)元細(xì)胞的調(diào)亡。

圖1NSC培養(yǎng)及鑒定×200A、B、C. 依次為培養(yǎng)2、4、6 d時(shí)所形成的神經(jīng)球； D. 巢蛋白抗體熒光染色后； E. DAPI抗體熒光染色后； F. D和E合成

Fig1Neuralstemcellcultureandidentification(×200)

圖2神經(jīng)干細(xì)胞分化后三系鑒定
A.TUJ1抗體熒光染色陽(yáng)性顯示神經(jīng)元 ×200； B.MOG抗體熒光染色陽(yáng)性顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞 ×400； C.GFAP抗體熒光染色陽(yáng)性顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞 ×200

Fig2Neuralstemcelldifferentiationafteridentificationofthreelines

近年來(lái)隨著干細(xì)胞研究的興起，NSCs也以其具有自我更新及自我分化的特點(diǎn)備受關(guān)注。NSCs能夠形成新的神經(jīng)元細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，改善周?chē)h(huán)境，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，對(duì)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)有一定的作用[18-19]。本研究通過(guò)將NSCs立體定向注射到大鼠腦缺血區(qū)，通過(guò)大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及檢測(cè)腦脊液中炎癥因子含量的變化來(lái)衡量顱內(nèi)炎癥反應(yīng)水平，探索NSCs移植對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后顱內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響。研究結(jié)果顯示：(1)NSCs移植后，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組神經(jīng)功能恢復(fù)得更快、更好，提示NSCs對(duì)大鼠顱內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)有促進(jìn)作用。(2)從大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥水平來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠腦脊液中IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1的含量不斷下降，此結(jié)果符合腦缺血再灌注損傷后炎癥反應(yīng)的一個(gè)正常觸發(fā)及衰退的過(guò)程。1、3、14 d實(shí)驗(yàn)組IL-1β、TNF-α含量比對(duì)照組低，而IL-10、TGF-β1含量比對(duì)照組高，提示NSCs移植后能夠使抗炎因子的表達(dá)上調(diào)，促炎因子的表達(dá)下調(diào)，從而改善腦缺血再灌注損傷后顱內(nèi)炎癥免疫微環(huán)境，降低顱內(nèi)的炎癥反應(yīng)水平，減少炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)顱腦神經(jīng)功能的修復(fù)。

圖3神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評(píng)分

Fig3Severityassessmentofneurologicaldeficits

圖4大鼠腦脊液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量的ELISA檢測(cè)結(jié)果

Fig4ELISAresultsofTNF-α,IL-1β,TGF-β1andIL-10incerebrospinalfluidofrats

NSCs的應(yīng)用前景十分樂(lè)觀，其潛在的治療作用近年研究很多，相信在眾多科研工作者不斷的努力下，NSCs移植很可能為缺血性腦損傷患者帶來(lái)福音。

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