董 波，安永帥，戴愛(ài)玲，李曉華，楊小燕，*

(1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建 龍巖 364012)

閩西地區(qū)豬流行性腹瀉病毒M基因遺傳進(jìn)化及分子結(jié)構(gòu)特征分析

董 波1，2，安永帥1，戴愛(ài)玲1，2，李曉華1，2，楊小燕1，2，*

(1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建 龍巖 364012)

摘 要：為了解2015—2017年閩西地區(qū)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)遺傳進(jìn)化規(guī)律，本研究收集了閩西地區(qū)12份PEDV陽(yáng)性樣品，對(duì)其M基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，克隆至pMD18-T載體測(cè)序，并與國(guó)內(nèi)外已知參考毒株序列進(jìn)行比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，12株閩西毒株M基因氨基酸序列同源性為100.0%；遺傳進(jìn)化分析表明，12株閩西毒株與經(jīng)典毒株CV777、2010年前中國(guó)分離毒株LCZ、以及韓國(guó)毒株SM98、virulent DR13的親緣性較遠(yuǎn)，而與2010年后國(guó)內(nèi)分離毒株以及2013年美國(guó)分離毒株親緣關(guān)系最近，說(shuō)明閩西PEDV毒株屬于目前國(guó)內(nèi)外流行毒株。分子結(jié)構(gòu)特征分析表明，PEDV M基因具備高度保守的特性，可以作為設(shè)計(jì)疫苗的候選基因。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；M基因；進(jìn)化特征；分子特征

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征，主要感染哺乳期仔豬，感染率和病死率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大損失[1-3]。該病第一次被報(bào)道于1971年的英國(guó)，之后在歐洲、亞洲相繼有該病的出現(xiàn)[4-5]。我國(guó)第一次出現(xiàn)該病是在1976年，繼而呈現(xiàn)大面積流行趨勢(shì)[6]。自2010年冬季以來(lái)，我國(guó)10多個(gè)省市暴發(fā)PED，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重影響，甚至出現(xiàn)以前接種過(guò)PED疫苗的豬也未能幸免，提示該流行毒株毒力較強(qiáng)，而且與現(xiàn)有疫苗毒株存在較大的差異，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗難以提供免疫保護(hù)[7-8]。2011年，張世忠等[9]對(duì)福建省各個(gè)地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬的頑固性腹瀉病例進(jìn)行檢測(cè)，PEDV感染率高達(dá)52.2%。由此可見(jiàn)，該病一旦暴發(fā)流行，其危害十分嚴(yán)重，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的潛在危害不容忽視。2013年，美國(guó)多個(gè)洲先后有暴發(fā)PEDV，病豬表現(xiàn)出水樣腹瀉、急性腸炎、嘔吐等典型癥狀，死亡率極高，給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重創(chuàng)，引起了美國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)的高度重視[10-11]。

PEDV為單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)大約28kb，由4種結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別為纖突蛋白(spike，S)、膜蛋白(membrane，M)、核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)和小膜蛋白(small membrane，E)[12]。其中，M基因全長(zhǎng)681bp，編碼226個(gè)氨基酸，位于病毒表面，是病毒囊膜中含量最多的基因[13]。M基因在PEDV的結(jié)構(gòu)基因中，相對(duì)較為保守，然而，近些年的相關(guān)文獻(xiàn)顯示，M基因也呈現(xiàn)了進(jìn)化和變異的趨勢(shì)。閩西地區(qū)地處閩粵贛三省交界，一旦出現(xiàn)病毒變異并迅速蔓延，對(duì)三省乃至全國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)將造成不小的影響。因此，本研究收集了2015年1月—2017年6月閩西地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)送檢PEDV陽(yáng)性病例，采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增陽(yáng)性樣品全長(zhǎng)M基因，旨在從分子水平了解PEDV閩西地區(qū)流行毒株的特點(diǎn)，進(jìn)一步闡明閩西地區(qū)流行毒株的遺傳變異規(guī)律，為我國(guó)PEDV地方毒株的遺傳演化分析提供基礎(chǔ)資料，并為下一步制備PEDV疫苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、野外樣品、質(zhì)粒與菌種

PEDV弱毒疫苗購(gòu)自福州大北農(nóng)公司；野外陽(yáng)性樣品為2015年1月—2017年6月年期間采自閩西地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)送檢腹瀉癥狀仔豬的糞便和小腸組織樣品12份；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室制備、保存；pMD18-T Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

DL2000 Marker、總RNA提取液(TaKaRa RNAiso Reagent)、病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 高保真酶、Oligo(dT)18、dNTP、DNA Marker DL 2000、RNA酶抑制劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)及質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Miniprep Kit)購(gòu)自AXYGEN公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞制備試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；氯仿、異丙醇采用分析純?cè)噭?/p>

1.3 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒提供的操作手冊(cè)，自糞便和小腸組織以及滅活的PEDV樣品(陽(yáng)性對(duì)照)中提取總RNA。取潔凈EP管，加入RNA 11μL、Oligo(dT)18 1μL，12000g離心40s，于70℃水浴10min，加入5×M-MLV Buffer 5μL、M-MLV 1μL、dNTP 1μL、DEPC水 6μL，混勻后，42℃水浴30min，95℃水浴10min。cDNA于-80℃下保存。

1.4 M基因的擴(kuò)增、純化

參考GenBank上發(fā)表的PEDV CV777株M基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，PEDV-M-F:TTCTATTCCCGTTGATGAGG；PEDV-M-R:CATGAAGCACTTTCTCACTATC。以cDNA為模板，擴(kuò)增病毒M基因。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，凝膠切割純化，凝膠成像系統(tǒng)下觀(guān)察結(jié)果。

1.5 重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定

取5μL純化產(chǎn)物與0.5μL pMD18-T載體(50 ng·μL-1)進(jìn)行連接反應(yīng)，16℃連接4h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板過(guò)夜，挑取單個(gè)白色菌落，每個(gè)樣品挑選3個(gè)菌落，以保證測(cè)序準(zhǔn)確性。過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 序列比對(duì)、同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用DNAman、DNAstar、MEGA5.2分子生物學(xué)軟件，對(duì)M基因序列進(jìn)行同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 M基因的擴(kuò)增、純化、克隆及測(cè)序

12份陽(yáng)性樣品編號(hào)為： FJLY1501、FJLY1502、FJLY1503、FJLY1504、FJLY1601、FJLY1602、FJLY16031、FJLY1604、FJLY1701、FJLY1702、FJLY1703、FJLY1704，對(duì)M基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。M基因PCR產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后，使用凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示獲得大小約為681bp基因片段(圖1)。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，將陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，序列結(jié)果正確。

2.2 M基因氨基酸序列比對(duì)及同源性分析

將12份陽(yáng)性樣品的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外已知代表毒株M基因序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析。所引用的已知代表毒株信息見(jiàn)表1。12份陽(yáng)性樣品M基因與其他代表性毒株M基因進(jìn)行氨基酸同源性比較后發(fā)現(xiàn)，閩西毒株M基因之間的同源性為100.0%，與經(jīng)典毒株CV777和LCZ的同源性分別為98.7%和98.6%，與2014年福建分離毒株FJ-ZP和FJ-FQ的同源性分別為99.6%和99.7%。與2010年以后中國(guó)分離毒株的同源性均在99%以上，與2013年美國(guó)毒株的同源性也均在99%以上。

2.3 M基因系統(tǒng)發(fā)育分析

遺傳進(jìn)化分析表明，42株P(guān)EDV可以分成兩個(gè)大組。其中，Ⅰ組包括經(jīng)典毒株CV777，3株韓國(guó)毒株，6株中國(guó)毒株;Ⅱ組則包括1株韓國(guó)毒株，4株美國(guó)毒株，22株2010年后中國(guó)毒株以及12株閩西分離毒株。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，閩西分離毒株與經(jīng)典毒株CV777、2010年前中國(guó)分離毒株LCZ、SM98以及韓國(guó)毒株virulent DR13的親緣性較遠(yuǎn)，與2010年以后中國(guó)分離毒株的親緣性較高，與2013年美國(guó)毒株親緣性也較高。見(jiàn)圖2。

2.4 M基因氨基酸結(jié)構(gòu)特征

M，DL2000 marker;1，陰性對(duì)照;2～13依次為FJLY1501、FJLY1502、FJLY1503、FJLY1504、FJLY1601、FJLY1602、FJLY16031、FJLY1604、FJLY1701、FJLY1702、FJLY1703、FJLY1704。M，DL2000 marker;1，Negative control;2-13，F(xiàn)JLY1501，F(xiàn)JLY1502，F(xiàn)JLY1503，F(xiàn)JLY1504，F(xiàn)JLY1601，F(xiàn)JLY1602，F(xiàn)JLY16031，F(xiàn)JLY1604，F(xiàn)JLY1701，F(xiàn)JLY1702，F(xiàn)JLY1703，F(xiàn)JLY1704.圖1 M基因PCR擴(kuò)增純化結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of M genes

表1序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析中引用的PEDV毒株

Table1Cited PEDV virus strains in sequence alignment and phylogenetic analysis

毒株Strain基因庫(kù)登錄號(hào)GenBank Accession No.國(guó)家Country年份YearCV777AF353511England1978virulent DR13JQ023161SouthKorea1999Attenuated DR13JQ023162SouthKorea2003SM98GU937797SouthKorea1998IA2KF468754USA2013ISU13-19338E-IN-homogenateKF650370USA 2013MNKF468752USA2013USA-Iowa-18984-2013KF804028USA2013CH-SJN547228China1986LZCEF185992China2006JS2008_KC109141KC109141China2008JS2008_KC210146KC210146China2008SD-MJX560761China2012CHGD-01JX261936China2011LCJX489155China2011AJ1102JX188454China2011BJ-2011-1JN825712China2011GD-AJXl12709China2012GD-BJX088695China2012GD-1JX647847China2011CH-FJZZ-9-2012KC140102China2012KC189944KC189944.China2012CH-GDGZ-2012KF384500China2013CH-FJND-3-2011JQ282909China2011JS-HZ2012KC210147China2012AH2012KC210145China2012CH-ZMDZY-11KC196276China2011FJ-FQKJ646594China2014FJ-ZPKJ646592China2014CH/HeN/FQ-2014KM048291China2014

圖2 PEDV M基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on M genes of PEDV

M基因在PEDV中是相對(duì)保守的基因，序列比對(duì)結(jié)果表明，M基因全長(zhǎng)為681bp，編碼226個(gè)氨基酸，包含一個(gè)完整的閱讀框架。閩西分離毒株與經(jīng)典毒株CV777相比，氨基酸序列僅存在3處突變，分別為12E-Q、42A-V、213A-S，見(jiàn)表2。這些突變位置與2010年后中國(guó)變異毒株一致。N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)典毒株CV777含有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，而閩西分離毒株的N-糖基化位點(diǎn)與經(jīng)典毒株CV777一致，見(jiàn)表3。M基因其他預(yù)測(cè)結(jié)果表明，閩西分離毒株的穿膜肽、疏水性、pI值等方面與經(jīng)典毒株CV777無(wú)明顯差異，見(jiàn)表4。

表3M基因潛在糖基化位點(diǎn)比對(duì)分析

Table3Alignment of mutant amino acids of potential glycosylation sites on M genes

病毒樣品Virus samples3-6aa19-22aaCV777NGSINFTWFJLY201501NGSINFTWFJLY201502NGSINFTWFJLY201503NGSINFTWFJLY201504NGSINFTWFJLY201601NGSINFTWFJLY201602NGSINFTWFJLY201603NGSINFTWFJLY201604NGSINFTWFJLY201701NGSINFTWFJLY201702NGSINFTWFJLY201703NGSINFTWFJLY201704NGSINFTW

表4M基因編碼蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)

Table4Predicted protein characterizations of deduced protein of M gene

病毒樣品Virus samples疏水區(qū)Hydrophobic region穿膜肽Cell-penetrating peptidepICV77722-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.31FJLY20150122-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20150222-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa 20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20150322-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20150422-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20160122-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa 20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20160222-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa 20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20160322-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20160422-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20170122-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa 20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20170222-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20170322-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54FJLY20170422-33aa;48-64aa;75-95aa;130-135aa;141-145aa20-38aa;43-65aa;75-97aa9.54

3 討論

PEDV是PED的致病原，主要感染對(duì)象為哺乳期仔豬，致死率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害非常嚴(yán)重。研究證實(shí)，PEDV只存在一個(gè)血清型，然而，分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，近十年來(lái)我國(guó)流行毒株與歐洲流行毒株、原始毒株比較，我國(guó)流行毒株的結(jié)構(gòu)蛋白基因(M、N、S)均與歐洲流行毒株及原始毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能出現(xiàn)了新的基因型[14]。2011年，劉孝珍等[15]將17株分離得到的PEDV S基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析研究，證實(shí)我國(guó)出現(xiàn)了PEDV新的基因型。M基因能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的中和抗體，在病毒粒子的組裝和出芽過(guò)程中具有重要作用[16]。M基因是高度保守的基因，能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，常用作RT-PCR診斷靶基因和疫苗候選基因[17]。在遺傳進(jìn)化的分析中，選擇M基因，有助于更多地了解病毒的流行趨勢(shì)與進(jìn)化規(guī)律，對(duì)于病毒的防控和疫苗的研制具有重要意義。

2011年冬末，廣東、福建等地區(qū)持續(xù)暴發(fā)仔豬腹瀉，引起了學(xué)者的關(guān)注，學(xué)者們普遍認(rèn)為，造成這次PEDV暴發(fā)的毒株為變異毒株。自此以后，該變異毒株成為我國(guó)主要流行毒株。2013年，張志等[18]將分離到的PEDV陽(yáng)性毒株M基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，新分離毒株M基因與2010年后我國(guó)新分離毒株親緣性較高，為國(guó)內(nèi)變異毒株。本研究中，閩西毒株M基因氨基酸序列與2010年以后中國(guó)分離毒株以及2013年美國(guó)毒株的同源性均在99%以上，證實(shí)了閩西流行毒株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)流行毒株關(guān)系密切，屬于2010年后國(guó)內(nèi)分離變異毒株。

2013年，美國(guó)暴發(fā)了豬流行性腹瀉，給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重影響，經(jīng)濟(jì)損失巨大。這次暴發(fā)的PEDV，與2010年我國(guó)暴發(fā)的PEDV的流行方式極為相似，并且學(xué)者通過(guò)進(jìn)化分析證實(shí)，2013年在美國(guó)暴發(fā)的PEDV與2010年在中國(guó)流行的PEDV，在親緣性上很相近，可以認(rèn)為來(lái)自同一祖先。本研究中，42株病毒可以分成2個(gè)大組，Ⅰ組和Ⅱ組。其中，Ⅰ組主要包括CV777、LZC和SM98為代表的的經(jīng)典株，以及韓國(guó)DR13弱毒株和國(guó)內(nèi)早期毒株；而Ⅱ組包含毒株均為2010年后中國(guó)分離毒株以及2013年后美國(guó)分離毒株，這也證實(shí)了閩西毒株與2010年后國(guó)內(nèi)分離毒株和2013年后美國(guó)分離毒株進(jìn)化關(guān)系更為緊密，為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外流行毒株。同時(shí)，親緣比較結(jié)果表明，閩西毒株與疫苗研發(fā)株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，提示我們現(xiàn)在豬場(chǎng)所使用的疫苗，對(duì)于防治PED的流行所起到的作用并不顯著，這也成為控制PEDV暴發(fā)的主要隱患。

M基因氨基酸結(jié)構(gòu)特征比較顯示，與經(jīng)典毒株CV777相比，閩西毒株無(wú)特有的片段缺失和插入，12份毒株存在3處相同突變，分別為12E-Q、42A-V、213A-S，這些突變位置與2010年后分離毒株一致，證實(shí)了閩西毒株屬于2010年后國(guó)內(nèi)分離變異毒株。閩西毒株N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果與經(jīng)典毒株CV777一致，且穿膜肽、親水性、pI值等方面與經(jīng)典毒株CV777也無(wú)差異，這些結(jié)果進(jìn)一步證明了PEDV M基因具備高度保守的特性，可以作為設(shè)計(jì)疫苗的候選基因。

綜上，通過(guò)比較分析2015—2017年閩西地區(qū)PEDV M基因氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，閩西毒株M基因與2010年國(guó)內(nèi)分離毒株以及2013年美國(guó)分離毒株同源性較高，屬于國(guó)內(nèi)外流行毒株。并且，蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果表明，雖然閩西毒株M基因與經(jīng)典毒株CV777相比存在3處基因改變，但是大部分性質(zhì)沒(méi)有明顯變化，證明M基因是高度保守的。這些結(jié)果的獲得，有助于從分子水平了解閩西地區(qū)PEDV M基因分子結(jié)構(gòu)及遺傳變異特征，為進(jìn)一步研制有效的生物制劑和診斷方法提供資料支持，同時(shí)為豬流行性腹瀉的防控提供病原學(xué)和流行病學(xué)參考依據(jù)。

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[1] 劉景華，殷震.動(dòng)物病毒學(xué) [M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997:681-688.

[2] 呂茂杰，陳建飛，時(shí)洪艷，等.豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細(xì)胞核磷蛋白的共定位分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2011，61(5):643-647.

LYU M J，CHEN J F，SHI H Y，et al.Co-localization analysis between porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid protein and nucleolar phosphoprotein B23.1[J].ActaMicrobiologicaSinica，2011，61(5):643-647.(in Chinese with English abstract)

[3] CAVANAGH D.Nidovirales:a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J].ArchivesofVirology，1997，142(3):629-633.

[4] WOOD E N.An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea[J].VeterinaryRecord，1977，100(12):243-244.

[5] PENSAERT M B，BOUCK P D.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].ArchivesofVirology，1978，58(3):243-247.

[6] 倪艷秀，林繼煌，何孔旺，等.豬流行性腹瀉研究概況[J].畜牧與獸醫(yī)，2001，33(1):38-40.

NI Y X，LIN J H，HE K W，et al.A survey of porcine epidemic diarrhea[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2001，33(1):38-40.(in Chinese)

[7] PAN Y，TIAN X，WEI L，et al.Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China[J].VirologyJournal，2012，9(1):195.

[8] SUN R Q，CAI R J，CHEN Y Q，et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J].EmergingInfectiousDiseases，2012，18(1):161-163.

[9] 張世忠，江斌.2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點(diǎn)及其防治措施[J].福建畜牧獸醫(yī)，2012，34(2):23-25.

ZHANG S Z，JIANG B.Epidemiological characteristics and control measures of swine epidemic diarrhea in Fujian Province in 2011[J].FujianJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，2012，34(2):23-25.(in Chinese)

[10] STEVENSON G W，HOANG H，SCHWARTZ K J，et al.Emergence of Porcine epidemic diarrhea virus in the United States:clinical signs，lesions，and viral genomic sequences[J].JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation，2013，25(5):649-654.

[11] CHEN Q，LI G，STASKO J，et al.Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States[J].JournalofClinicalMicrobiology，2014，52(1):234-243.

[12] BRIAN D A，BARIC R S.Coronavirus genome structure and replication[J].CurrentTopicsinMicrobiology&Immunology，2005，287:1-30.

[13] VENNEMA H，DE GROOT R J，HARBOUR D A，et al.Primary structure of the membrane and nucleocapsid protein genes of feline infectious peritonitis virus and immunogenicity of recombinant vaccinia viruses in kittens[J].Virology，1991，181(1):327-335.

[14] 陳建飛，馮力，時(shí)洪艷，等.豬流行性腹瀉病毒CH/S株N蛋白基因的遺傳變異及其原核表達(dá)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(11):856-860.

CHEN J F，F(xiàn)ENG L，SHI H Y，et al.Genetic variation and prokaryotic expression of N protein gene of porcine epidemic diarrhea virus CH/S strain[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2007，29(11):856-860.(in Chinese with English abstract)

[15] 劉孝珍，陳建飛，時(shí)洪艷，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(3):180-183.

LIU X Z，CHEN J F，SHI H Y，et al.Genetic variation analysis of porcine epidemic diarrhea virus isolated in 2011[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2012，34(3):180-183.(in Chinese with English abstract)

[16] DE HAAN C A，KUO L，MASTERS P S，et al.Coronavirus particle assembly:primary structure requirements of the membrane protein[J].JournalofVirology，1998，72(8):6838-6850.

[17] REN X，LI P.Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus[J].VirusGenes，2011，42(2):229-235.

[18] 張志，李嵐，董雅琴，等.豬流行性腹瀉病毒PCR檢測(cè)及其M基因的遺傳變異分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(8):13-18.

ZHANG Z，LI L，DONG Y Q，et al.PCR detection of porcine epidemic diarrhea virus and genetic analysis of M gene[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2013，34(8):13-18.(in Chinese with English abstract)

EvolutionaryandmolecularcharacteristicsofMgenesofporcineepidemicdiarrheavirusesinwesternFujian，China

DONG Bo1，2，AN Yongshuai1，DAI Ailing1，2，LI Xiaohua1，2，YANG Xiaoyan1，2，*

(1.CollegeofLifeScienceofLongyanUniversity，Longyan364012，China;2.FujianEngineeringResearchCenterforSwineDiseaseControlandPrevention，Longyan364012，China)

Abstract:To elucidate evolutionary characteristics of the memberane(M) genes of porcine epidemic diarrhea viruses in Fujian，China，12 samples collected from Fujian province during 2015 to 2017 were screened by multiplex RT-PCR，M genes of PEDV viruses from positive samples were amplified by RT-PCR and cloned into pMD18-T vectors for sequencing respectively.The sequence data were done alignment and phylogenetic analysis with sequences from known reference strains.The M genes from 12 representative positive samples shared100.0% identity at amino acid level.12 representative positive samples are remote to classical strain CV777，SM98 and virulent DR13.12 representative strains belong to the genotype variant strain.Molecular structure characteristics analysis showed that M gene is highly conservative and could be an optimal candidate protein for vaccine development.

Key words:porcine epidemic diarrhea virus;M gene;evolutionary characteristics;molecular characteristic

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.28

A

文章編號(hào)：1004-1524(2018)06-0939-07

收稿日期：2017-09-28

基金項(xiàng)目：福建省科技廳重大專(zhuān)項(xiàng)專(zhuān)題(2014NZ0002)；福建省高校自然基金青年重點(diǎn)項(xiàng)目(JZ160481)；福建省教育廳中青年科技項(xiàng)目(JAT160483)；龍巖學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目(LB2014004)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(2016017)

作者簡(jiǎn)介：董波(1983—)，男，天津人，博士，講師，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。E-mail:381289930@qq.com

，楊小燕，E-mail：1906834157@qq.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.08

(責(zé)任編輯張 韻)