趙 畫 ，曾令高

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121； 2.上海市食品藥品包裝材料測試所，上海 201203）

青蒿素是從中藥青蒿中提取的有過氧基團的倍半萜內酯類化合物，具有抗瘧疾作用，由我國在20世紀70年代獨立研制，并于1986年獲批為國家一類新藥。由于其生物利用度低，后續(xù)研發(fā)出雙氫青蒿素、青蒿琥酯等半倍萜內酯化合物青蒿素的衍生物，均作為一類新藥獲準上市[1]。青蒿琥酯作為其衍生物之一，具有更好的生物利用度，臨床用于瘧疾、寄生蟲病甚至腫瘤、病毒等的治療[2－9]。其合成工藝大多以青蒿素為起始原料，合成過程中易引入起始原料青蒿素、中間體雙氫青蒿素及降解產物等潛在雜質，在合成及儲存過程中受熱易分解產生雙氫青蒿素、脫水雙氫青蒿素等降解產物。因此，對青蒿琥酯及其制劑的工藝雜質及降解產物進行研究和控制十分有必要。目前，2016年版《國際藥典》和2015年版《中國藥典（二部）》[10]收錄了青蒿琥酯及其制劑中有關物質的檢查方法，但雜質I的獲取和結構表征未見報道。本研究中對已收載的檢測方法進行了比較及優(yōu)化，最終確定了適合青蒿琥酯及其片劑和注射用制劑的檢測方法，并對難以獲得對照品的雜質I（脫水雙氫青蒿素）提供了定性獲取方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀；XS205型電子天平(梅特勒公司，感量為 0.01 mg/0.1 mg)；CP224 型電子天平(賽多利斯公司)；FD240型烤箱(德國賓德公司)。

1.2 試藥

青蒿琥酯（市售品）；青蒿琥酯片（市售品，規(guī)格為每片50 mg或100 mg）；注射用青蒿琥酯（市售品，規(guī)格為每瓶60 mg）；青蒿琥酯對照品（批號為100200－201003），雙氫青蒿素對照品（批號為 100184－200401），青蒿素對照品（批號為100202－201004），均購自中國食品藥品檢定研究院；脫水雙氫青蒿素對照品（上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，含量為83.73%）；乙腈為色譜純；試驗用水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜條件：色譜柱為DikmaDiamonsilC18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液（pH ＝ 3.0） － 乙腈（56∶44）；流速為 1.0mL/min；檢測波長為 216nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。青蒿琥酯無共軛吸收，參考《國際藥典》標準，檢測波長選用216nm。采用外標法測定。

系統(tǒng)適用性試驗：取經100℃熱破壞30 min的青蒿琥酯原料干粉0.101 90 g，青蒿素對照品0.010 71 g，雙氫青蒿素對照品0.012 11 g，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，即得系統(tǒng)適用性試驗溶液，取20 μL進樣，色譜圖見圖 1。雙氫青蒿素（峰2）和青蒿琥酯（峰3）分離度為2.97，各雜質峰相對于青蒿琥酯的保留時間，雙氫青蒿素為 0.57和 0.91，青蒿素為 1.31，雜質 I為 2.74。

圖1 青蒿琥酯系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

2.2 溶液制備

供試品溶液：取青蒿琥酯或注射用青蒿琥酯粉末40 mg，分別置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為青蒿琥酯相應供試品溶液；取青蒿琥酯片，研為細粉，取適量（約相當于青蒿琥酯 40 mg），置10 mL容量瓶中，加乙腈適量，振搖或超聲15 min使溶解，冷卻，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為青蒿琥酯片供試品溶液。

對照溶液：精密量取青蒿琥酯、注射用青蒿琥酯和青蒿琥酯片供試品溶液各1 mL，分別置100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別作為其對照溶液。

2.3 測定方法

精密量取供試品溶液和對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：1）酸破壞，取青蒿琥酯約100 mg，置25 mL容量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液 5 mL，水浴加熱5 min，取出放冷，用氫氧化鈉溶液調至中性，加乙腈至刻度，濾過；2）堿破壞，取青蒿琥酯約100 mg，置25 mL容量瓶中，加 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液 5 mL，振搖5 min，用鹽酸溶液調至中性，加乙腈至刻度，濾過；3）氧化破壞，取青蒿琥酯約40 mg，置10 mL容量瓶中，加30%H2O2溶液2 mL，水浴加熱10 min，取出放冷，加乙腈至刻度，濾過；4）光破壞，取青蒿琥酯，在4 500 lx光強度照射下，7 d后取樣 40 mg，加乙腈 10 mL溶解；5)高溫破壞，取青蒿琥酯置平皿中，敞口放于100℃培養(yǎng)箱中，6 h后，取樣40 mg，加乙腈10 mL溶解。按上述有關物質檢查法各進樣20 μL測定，記錄色譜圖。結果表明，上述高效液相色譜（HPLC）法能使按強制破壞方法獲取的各雜質與青蒿琥酯有效分離，專屬性強。

耐用性試驗：照2.1項下色譜條件和方法配制系統(tǒng)適用性溶液，分別考察了在不同品牌填料的色譜柱中青蒿琥酯峰與10－異構－雙氫青蒿素峰的分離情況。結果各型號色譜柱均能達到分離要求，表明該色譜系統(tǒng)適用于目前市場上的絕大多數(shù)C18色譜柱。

相對響應因子考察：稱取青蒿琥酯、雙氫青蒿素、青蒿素和雜質 I（含量 83.73% ）對照品 0.010 18，0.010 09，0.010 42，0.010 14 g，置同一 10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度。按2.1項下色譜條件測定，計算各峰與青蒿琥酯峰的響應因子。因考慮到雙氫青蒿素在乙腈中溶解度不好，故未考察4 mg/mL的質量濃度響應因子。結果見表1。

表1 相對響應因子考察結果

定量限及檢測限測定：取相對響應因子考察項下溶液5.0 mL，置100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得雙氫青蒿素、青蒿素和雜質I質量濃度分別為0.050 45，0.052 10，0.050 70 mg/mL 的溶液，量取 5 μL 進樣，記錄色譜圖。以信噪比（S/N）為3或10計算檢測限及定量限，雙氫青蒿素為 0.105 4 μg 和 0.351 3 μg，10 － 異構 － 雙氫青蒿素為 0.299 1 μg 和 0.997 0 μg，青蒿素為0.182 6 μg 和 0.608 6 μg， 雜 質 I 為 0.031 4 μg 和0.104 8 μg。

2.5 雜質 I結構確認

在熱破壞中發(fā)現(xiàn)，相對保留時間2.7處有1個較大雜質，2016年版《國際藥典》中提出其為雜質C（脫水雙氫青蒿素），2015年版《中國藥典》命名為雜質I。為確保熱破壞產生的雜質即為雜質I，對其進行了結構確認。

定性獲取：采用Waters2695型高效液相色譜儀試驗。色譜條件為 Phenomenex Luna C18（2）色譜柱（100 mm ×4.6 mm，3 μm），流速 1.0 mL/min，流動相為磷酸緩沖液（pH ＝3.0）－乙腈（56∶44）。為確保熱破壞獲得的雜質 I滿足檢測限要求，首先采用極限破壞試驗，取100℃加熱破壞31 h的原料干粉0.01 g，置25 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得供試品熱破壞溶液。在長時間熱破壞條件下，青蒿琥酯峰絕大多數(shù)降解為雜質I。

保留時間確認：取雜質I對照品適量，用乙腈配置成質量濃度為1 g/L的溶液，取此溶液和供試品熱破壞溶液各20 μL，進樣，色譜圖見圖2。結果保留時間一致。

圖2 雜質I確認高效液相色譜圖

二級質譜確認：取雜質I對照品和供試品熱破壞溶液進行分子量確認。儀器為Waters TQD－UPLC型超高效液相質譜聯(lián)用儀。質譜條件為，電噴霧正離子化，噴霧電壓3 kV，錐孔電壓35 V；二級質譜掃描子離子模式，碰撞能量8 eV。色譜條件為，AIQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流速為 0.5 mL/min，流動相為乙腈－水（44∶56）。通過對2種溶液中雜質 I的一級質譜及二級質譜的比對，發(fā)現(xiàn)其質譜裂解行為一致。

相對分子質量確認：對供試品熱破壞溶液中雜質I的分子量進行確認。儀器為Waters四極桿飛行時間串聯(lián)質譜－超高效液相色譜儀。質譜條件為，電噴霧正離子化，噴霧電壓 3 kV，錐孔電壓 35 V。色譜條件為AIQUITYUPLCBEHC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm），流速為 0.5 mL/min，流動相為乙腈 － 水（44 ∶56）。結果推測出來的相對分子質量為267.157 8，提供的結構式僅為I15H23O4，這與2011年版《國際藥典》提供的雜質I（脫水雙氫青蒿素）的分子式和相對分子質量一致，確認熱破壞的雜質峰即為雜質I。

2.6 樣品有關物質測定

取青蒿琥酯、青蒿琥酯片和注射用青蒿琥酯供試品，照2.1項下系統(tǒng)適用性試驗方法處理，結果有不同程度的雜質檢出。結果見表2。

3 討論

對青蒿琥酯進行強制降解試驗，并對其降解產物進行分析，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對強光條件穩(wěn)定。在高溫條件下，容易降解產生雜質脫水雙氫青蒿素；在強氧化，強酸和強堿條件下均不穩(wěn)定，產生雙氫青蒿素及其他未知雜質，通過對已知雜質對照品的液相保留時間確認確定了雙氫青蒿素、青蒿素的出峰順序和與青蒿琥酯的相對保留時間。

由于市售脫水雙氫青蒿素對照品難以購買，《中國藥典》采用相對保留時間對雜質I進行定位。但在實際檢驗中，以相對保留時間定位雜質可能會出現(xiàn)混淆，難以對特定雜質進行準確定位。為更準確定位雜質I，采用熱破壞后，與對照品保留時間和二級質譜的方法同時對其進行確認，并經過試驗發(fā)現(xiàn)，熱破壞30 min即可產生雜質I，在不采用雜質對照品的同時準確定位雜質I，便于檢測過程中進行定性控制。

表2 青蒿琥酯原料及其制劑有關物質測定結果（%）

通過雜質對照品和二級質譜的方式對已知雜質進行了確認，發(fā)現(xiàn)其相較主要成分保留穩(wěn)定，并對其檢測限和定量限進行了測試，結果表明，該方法可以準確地分析樣品中的已知和未知雜質。

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