張 聘，張林香，趙建寧，張 雷

［1南京醫(yī)科大學(xué)金陵臨床醫(yī)學(xué)院(解放軍南京總醫(yī)院)骨科,2解放軍南京總醫(yī)院麻醉科,3解放軍南京總醫(yī)院骨科,江蘇 南京210002］

0 引言

滑膜間充質(zhì)干細胞(synovium-derived mesenchymal stem cells,SMSCs)可以從正?；蚬顷P(guān)節(jié)炎滑膜組織中獲得［1］,具有良好的多項分化潛能,相較于其他間充質(zhì)干細胞成軟骨分化能力更強［2］,并且滑膜組織再生能力強,臨床上取材方便,目前被廣泛用于軟骨組織工程中。

MicroRNA(miRNA)是一類長約22 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA,主要通過參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實現(xiàn)對靶基因的表達調(diào)節(jié),其在腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物發(fā)育、器官形成、表觀調(diào)控及代謝等方面發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用。已有大量研究［3－4］表明miRNA參與調(diào)控間充質(zhì)干細胞成軟骨分化。在既往關(guān)于miR-202-3p的研究中,Zhou等［5］通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)是miR-202-3p的直接靶點,MMP與其特異性組織抑制因子之間的失衡是骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)軟骨降解的重要原因之一。Wainwright等［6］發(fā)現(xiàn)pri-miR-202可能是Sox9基因的一個直接轉(zhuǎn)錄靶點。Zhang等［7］發(fā)現(xiàn)miR-202能夠通過互補配對結(jié)合Sox6 3'-UTR從而調(diào)控Sox6基因表達,Sox6、Sox9基因在軟骨分化過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。課題組利用microRNA基因芯片技術(shù)檢測長鏈非編碼RNA DANCR誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細胞成軟骨分化過程中miRNA的表達情況,篩選出在分化不同時期表達明顯差異的miRNA［8］,其中miR-202-3p在誘導(dǎo)分化后期表達明顯降低。綜合以上研究結(jié)果,推測miR-202-3p可能在軟骨細胞代謝及分化過程中發(fā)揮重要作用。

基于以上研究背景,實驗構(gòu)建miR-202-3p抑制劑表達載體轉(zhuǎn)染人SMSCs,觀察其對SMSCs增殖以及成軟骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計細胞體外觀察性實驗。

1.2 時間及地點實驗于2016年11月至2017年11月在解放軍南京總醫(yī)院完成。

1.3 材料滑膜組織:選擇在解放軍南京總醫(yī)院住院并進行全膝關(guān)節(jié)置換的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者10例,其中男5例,女5例,平均年齡65歲,術(shù)中獲取需要切除的膝關(guān)節(jié)髕上囊部位滑膜組織。研究開始前均取得患者同意并簽署知情同意書。研究內(nèi)容經(jīng)解放軍南京總醫(yī)院倫理部門審核并批準(zhǔn)。

主要試劑及儀器:miR-202-3p inbibitor及其對照inhibitor-NC由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司合成；間充質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)；甲苯胺藍(成都貝斯特試劑有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；cDNA第一鏈合成試劑盒(美國 Thermo Fisher K1622)；倒置相差顯微鏡(Nikon TMS顯微鏡)。

1.4 實驗方法

1.4.1 SMSCs的分離和培養(yǎng) 獲取行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者的滑膜,按照 Pei等［9］的方法分離滑膜干細胞。取術(shù)中切除的髕上囊部位的滑膜,無菌條件下轉(zhuǎn)移至超凈工作臺,PBS沖洗3次。剪除多余的脂肪和結(jié)締組織,分離出平滑光亮的滑膜組織,將其剪碎至1 mm3大小。加入0.2%濃度的Ⅱ型膠原酶在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)消化4 h。經(jīng)120目尼龍網(wǎng)過濾,濾液移至離心管,1000 rpm離心10 min棄去上清液。以1×104個有核細胞平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶中,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HG-DMEM、10%胎牛血清、1%青霉素+鏈霉素)中培養(yǎng)。24 h后換液棄去未貼壁的細胞,此時獲得原代SMSCs,繼續(xù)培養(yǎng),待細胞鋪滿80%時,以1∶3進行傳代培養(yǎng)。第3代細胞即為人SMSCs。

1.4.2 SMSCs的鑒定 采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原。取第3代貼壁SMSCs,0.25%胰酶消化重懸至1.5×106/mL,各管分別加入單克隆抗體 CD44、CD90、CD45、CD34,同時每管樣品設(shè)立同型陰性對照。室溫避光孵育45 min,用PBS洗去未結(jié)合抗體,重懸細胞,流式細胞儀進行檢測分析。

1.4.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取第3代貼壁SMSCs,細胞密度達到80%時,加入1 mL培養(yǎng)基。將Lipo2000和miRNA-202-3p inhibitor混勻,室溫孵育20 min,然后將miRNA-202-3p inhibitor-lipo2000混合液加入含細胞的培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后,將含有miRNA-202-3p inhibitor-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去,更換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同樣方法轉(zhuǎn)染miRNA-202-3p inhibitor NC,設(shè)為對照組。qRT-PCR檢測miR-202-3p表達水平。

1.4.4 CCK-8檢測 細胞消化、計數(shù)、配制成濃度為3×104/mL的細胞懸液,96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液,將96孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d,將96 孔板進行CCK-8 染色,λ＝450 nm,測定OD值,繪制細胞生長曲線。

1.4.5 微團培養(yǎng)誘導(dǎo)SMSCs軟骨分化 分別取inhibitor組、NC組的 SMSCs,按照 7.5×105/mL的密度重懸,吸取0.5 mL細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞團出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象時,輕彈離心管使其懸浮于液體中。每3天更換1次培養(yǎng)基,每管約0.5 mL軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,持續(xù)培養(yǎng)21 d。

1.4.6 組織學(xué)檢測 采用堿性甲苯胺藍染色方法鑒定軟骨細胞。自然晾干細胞樣本,浸入4%的多聚甲醛固定液中30 min,PBS浸洗3次,0.1%堿性甲苯胺藍液浸染30 min,水洗,入冰醋酸液分化,直至胞核和顆粒清晰,風(fēng)干,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。

1.4.7 qRT-PCR檢測 收集各組成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的細胞團,使用TRIzol試劑提取各組總RNA,通過cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將cDNA樣品配置Real-time PCR反應(yīng)體系:SYRB Green PCR Master Mix 10 μL,cDNA 模板 1 μL,上游和下游引物各 1 μL,0.1%DEPC 水 7 μL,總體積 20 μL。 置于Real-time PCR儀上進行PCR反應(yīng)。檢測軟骨細胞特異性基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9的表達,NC組的細胞作為陰性對照,以GAPDH為內(nèi)參照(表1)。

表1 引物序列

1.5 觀察指標(biāo)轉(zhuǎn)染miR-202-3p抑制劑后,對人SMSCs增殖的影響；轉(zhuǎn)染miR-202-3p抑制劑后,對誘導(dǎo)人SMSCs成軟骨分化相關(guān)基因(Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、Sox9)表達的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果用SPSS17.0軟件進行分析,兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗,數(shù)據(jù)以±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMSCs細胞形態(tài)學(xué)觀察SMSCs接種48 h后開始貼壁生長,顯微鏡下可見大量細胞,形態(tài)多樣,以多角形為主,細胞核位于細胞中心,細胞質(zhì)呈放射狀向外突起(圖1A),隨著傳代次數(shù)增加,SMSCs趨向成形態(tài)單一的長梭形(圖1B),至第3代,鏡下可見大量按特定方向排列的形態(tài)一致的長梭形細胞(圖1C)。

圖1 SMSCs的形態(tài)(×200)

2.2 流式細胞儀檢測SMSCs表面抗原流式細胞檢測細胞表面抗原:CD44、CD90、CD45、CD34。 其中CD44、CD90 呈陽性表達(陽性率＞95%),CD45、CD34呈陰性表達(＜10%),與間充質(zhì)干細胞特點相符(圖 2)。

圖2 流式細胞術(shù)鑒定結(jié)果

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMSCsqRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染抑制劑組細胞中miR-202-3p表達明顯低于陰性對照組,表明轉(zhuǎn)染 miR-202-3p inhibitor后能有效沉默SMSCs中miR-202-3p的表達(圖3)。

圖3 qRT-PCR檢測SMSCs中miR-202-3p的表達水平

2.4 細胞增殖分析從轉(zhuǎn)染后第3天起,miR-202-3p inhibitor組的細胞增殖率明顯高于陰性對照組,這說明抑制SMSCs中的miR-202-3p可明顯提高SMSCs的增殖活性(圖4)。

圖4 連續(xù)培養(yǎng)7 d細胞增殖情況

2.5 甲苯胺藍染色結(jié)果成軟骨誘導(dǎo)21 d后,行甲苯胺藍染色,可見實驗組和陰性對照組細胞外基質(zhì)均呈藍色,表明細胞外基質(zhì)中有糖胺聚糖形成,符合軟骨細胞細胞外基質(zhì)特征,miR-202-3p inhibitor組藍染更明顯,細胞數(shù)量更多(圖5)。

圖5 實驗組與對照組SMSCs成軟骨誘導(dǎo)后甲苯胺藍染色結(jié)果(×200)

2.6 軟骨細胞相關(guān)基因表達qRT-PCR結(jié)果顯示,實驗組軟骨細胞特異性基因(Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖、Sox9)的表達明顯高于陰性對照組(圖6),說明抑制miR-202-3p表達能夠促進Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9的合成,對SMSCs的軟骨形成能力有促進作用。

圖6 qRT-PCR檢測SMSCs成軟骨誘導(dǎo)后軟骨特異性基因的表達

3 討論

創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等常引起關(guān)節(jié)軟骨缺損。由于軟骨組織缺乏血供、愈合能力差,成人關(guān)節(jié)軟骨缺損很難自我修復(fù)。SMSCs在既往研究中表現(xiàn)出良好的軟骨再生效果［10］。 Kondo 等［11］發(fā)現(xiàn) SMSCs 有著與軟骨細胞相似的基因表達譜,說明二者可能來源于同一種前體細胞。相較于其他來源的間充質(zhì)干細胞,SMSCs具有更強的成軟骨分化能力,目前是軟骨組織工程最主要的種子細胞。

本實驗室利用miRNA芯片檢測SMSCs成軟骨分化前后miRNA的表達譜,發(fā)現(xiàn)miR-202-3p表達明顯降低,并且miR-202-3p在多種細胞增殖過程中都起到抑制作用［12－15］,所以推測 miR-202-3p 可能為SMSCs軟骨分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果表明,抑制miR-202-3p的表達能夠顯著促進SMSCs增殖,同時軟骨特異性基因的表達也顯著提高,證實了miR-202-3p與軟骨分化及修復(fù)有密切關(guān)系。

MiRNA主要通過結(jié)合目標(biāo)mRNA的3'-UTR,誘導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA翻譯,從而調(diào)控目標(biāo)基因的表達［16］。通過檢索 TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-202-3p直接互補配對結(jié)合Sox6 3'-UTR的第2290-2296和6261-6267位點,保守互補序列分別為5'-ACAUUUCA-3'、5'-UACCUCA-3',并且 Zhang 等［7］的實驗證實miR-202負(fù)向調(diào)控Sox6的表達。Sox6和L-Sox5共同提高 Sox9的轉(zhuǎn)錄活性［17］。MiR-202-3p與Sox9無互補配對序列,Sox9不是miR-202-3p的直接靶目標(biāo)。本實驗中抑制miR-202-3p表達后,可能提高了Sox6的表達,從而引起Sox9表達增加。而Col2A1是Sox9依賴性的軟骨細胞特異性增殖基因,Col2A1在軟骨細胞中的表達與Sox9呈正比關(guān)系,Col2A1的增高可能是由Sox9的增高引起的。

MiRNAs具有非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),往往一個miRNA可以調(diào)控多種靶基因,而同一個靶基因也可以由很多miRNAs來進行調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)確認(rèn)的miRNA在軟骨形成與分化過程中調(diào)控的靶點包括Sox 家族［18－19］、TGF-β 通路［8,20－21］、BMP 通路［22］、Wnt通路［3］、MAPK 通路［23］等。 Zhang 等［8］認(rèn)為軟骨分化可能潛在地是由 TGF-β引起的,既往的研究［24－26］發(fā)現(xiàn)TGF-β1可通過多條信號通路參與間充質(zhì)干細胞成軟骨分化過程,而且研究［27－28］發(fā)現(xiàn) TGF-β1可以誘導(dǎo)miR-202表達。在SMSCs成軟骨分化中,miR-202-3p可能也受到TGF-β1調(diào)控,并且可能在多條通路中都發(fā)揮調(diào)控作用,具體的機制還有待進一步研究。

研究microRNA在軟骨細胞增殖、分化過程中的作用十分有意義,能夠為利用間充質(zhì)干細胞和RNA干擾技術(shù)進行軟骨損傷修復(fù)及對骨關(guān)節(jié)炎的治療提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù),我們期待干細胞和RNA技術(shù)給臨床治療軟骨缺損帶來新的突破。

［1］Trounson A,McDonald C.Stem cell therapies in clinical trials:Progress and challenges［J］.Cell Stem Cell,2015,17(1):11－22.

［2］Fan J,Varshney RR,Ren L,et al.Synovium-derived mesenchymal stem cells:a new cell source for musculoskeletal regeneration［J］.Tissue Eng Part B Rev,2009,15(1):75－86.

［3］Zhang Y,Huang X,Yuan Y.MicroRNA-410 promotes chondrogenicdifferentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells through down-regulating Wnt3a［J］.Am J Transl Res,2017,9(1):136－145.

［4］閆繼紅,楊 姝,孫海梅,等.共沉默miR-221-3p/222-3p表達移植骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及促成軟骨分化［J］.中國組織工程研究,2015,19(50):8056－8061.

［5］Zhou B,Zhu H,Luo H,et al.MicroRNA-202-3p regulates scleroderma fibrosis by targeting matrix metalloproteinase 1［J］.Biomed Pharmacother,2017,87:412－418.

［6］Wainwright EN,Jorgensen JS,Kim Y,et al.SOX9 regulates microRNA miR-202-5p/3p expression during mouse testis differentiation［J］.Biol Reprod,2013,89(2):34.

［7］Zhang D,Li Y,Tian J,et al.MiR-202 promotes endometriosis by regulating SOX6 expression［J］.Int J Clin Exp Med,2015,8(10):17757－17764.

［8］Zhang L,Sun X,Chen S,et al.Long noncoding RNA DANCR regulates miR-1305-Smad 4 axis to promote chondrogenic differentiation of human synovium-derived mesenchymal stem cells［J］.Biosci Rep,2017,37(4):BSR20170347.

［9］Pei M,Zhang Y,Li J,et al.Antioxidation of decellularized stem cell matrix promotes human synovium-derived stem cell-based chondrogenesis［J］.Stem Cells Dev,2013,22(6):889－900.

［10］崔 巖,馬承斌,孫 楠,等.骨性關(guān)節(jié)炎滑膜間充質(zhì)干細胞分化能力研究［J］.臨床軍醫(yī)雜志,2016,44(3):224－229.

［11］Kondo S,Muneta T,Nakagawa Y,et al.Transplantation of autologous synovial mesenchymal stem cells promotes meniscus regeneration in aged primates［J］.J Orthop Res,2017,35(6):1274－1282.

［12］Zhao Z,Lv B,Zhang L,et al.miR-202 functions as a tumor suppressor in non-small cell lung cancer by targeting STAT3［J］.Mol Med Rep,2017,16(2):2281－2289.

［13］Zhang Y,Zheng D,Xiong Y,et al.miR-202 suppresses cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by downregulating LRP6 post-transcriptionally［J］.FEBS Lett,2014,588(10):1913－1920.

［14］Wang Q,Huang Z,Guo W,et al.microRNA-202-3p inhibits cell proliferation by targeting ADP-ribosylation factor-like 5A in human colorectal carcinoma［J］.Clin Cancer Res,2014,20(5):1146－1157.

［15］Shen X,Guo Y,Yu J,et al.miRNA-202 in bone marrow stromal cells affects the growth and adhesion of multiple myeloma cells by regulating B cell-activating factor［J］.Clin Exp Med,2016,16(3):307－316.

［16］Muhammad Shazwan S,Muhammad Aliff M,Asral Wirda AA,et al.MicroRNA expression in antiphospholipid syndrome:a systematic review and microRNA target genes analysis［J］.Malays J Pathol,2016,38(3):273－283.

［17］Yamashita S,Miyaki S,Kato Y,et al.L-Sox5 and Sox6 proteins enhance chondrogenic miR-140 microRNA expression by strengthening dimeric Sox9 activity［J］.J Biol Chem,2012,287(26):22206－22215.

［18］Karlsen TA,Jakobsen RB,Mikkelsen TS,et al.MicroRNA-140 targets RALA and regulates chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by translational enhancement of SOX9 and ACAN［J］.Stem Cells Dev,2014,23(3):290－304.

［19］Yang B,Guo H,Zhang Y,et al.MicroRNA-145 regulates chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells by targeting Sox9［J］.PloS One,2011,6(7):e21679.

［20］Hou C,Yang Z,Kang Y,et al.MiR-193b regulates early chondrogenesis by inhibiting the TGF-beta2 signaling pathway［J］.FEBS Lett,2015,589(9):1040－1047.

［21］Anderson BA,McAlinden A.miR-483 targets SMAD4 to suppress chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.J Orthop Res,2017,35(11):2369－2377.

［22］Ning G,Liu X,Dai M,et al.MicroRNA-92a upholds Bmp signaling by targeting noggin3 during pharyngeal cartilage formation［J］.Dev Cell,2013,24(3):283－295.

［23］Mei Y,Bian C,Li J,et al.miR-21 modulates the ERK-MAPK signaling pathway by regulating SPRY2 expression during human mesenchymal stem cell differentiation［J］.J Cell Biochem,2013,114(6):1374－1384.

［24］Xia P,Wang X,Qu Y,et al.TGF-β1-induced chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells is promoted by low-intensity pulsed ultrasound through the integrin-mTOR signaling pathway［J］.Stem Cell Res Ther,2017,8(1):281.

［25］Jiang X,Huang B,Yang H,et al.TGF-β1 is involved in vitamin D-induced chondrogenic differentiation ofbone marrow-derived mesenchymal stem cells by regulating the ERK/JNK pathway［J］.Cell Physiol Biochem,2017,42(6):2230－2241.

［26］Wang Y,Chen J,Fan W,et al.Stromal cell-derived factor-1α and transforming growth factor-β1 synergistically facilitate migration and chondrogenesis of synovium-derived stem cells through MAPK pathways［J］.Am J Transl Res,2017,9(5):2656－2667.

［27］Lin Z,Song D,Wei H,et al.TGF-β1-induced miR-202 mediates drug resistance by inhibiting apoptosis in human osteosarcoma［J］.J Cancer Res Clin Oncol,2016,142(1):239－246.

［28］Mody HR,Hung SW,Pathak RK,et al.miR-202 diminishes TGFβ receptors and attenuates TGFβ1-induced EMT in pancreatic cancer［J］.Mol Cancer Res,2017,15(8):1029－1039.