賀傳勇，陳 典，鄒 毅，谷 新，李新新, 廖 荔

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院(恩施 445000)

硒作為一種人體必需的微量元素，在多種生理活動中扮演重要角色，大量的流行病學(xué)及臨床數(shù)據(jù)[1]表明，它具有預(yù)防和治療前列腺癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的作用，探究硒的抗癌分子機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)。關(guān)于硒與人類健康研究較多，硒能防治腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但主要集中在如肝癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的研究中，而在婦科腫瘤方面的研究報道較少。子宮頸癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在婦科腫瘤中位于第2位，死亡率居婦女惡性腫瘤之首。我國宮頸癌發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅著女性健康。到目前為止，子宮頸癌的確切病因仍不完全清楚，認(rèn)為引起子宮頸癌的主要原因有未成年即有性生活、多個性伴侶、多產(chǎn)、性病患者、單純皰疹病毒(HSV-2)感染等。血管生成素-2、血小板反應(yīng)素-1與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[2]。除了上述因素以外，一些地理環(huán)境如硒缺乏等因素，也與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)[3]。本研究通過檢測宮頸癌患者硒含量，以及硒結(jié)合蛋白(SEBP1)在不同宮頸組織的表達(dá)與宮頸癌關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)SEBP1與宮頸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，為宮頸癌臨床診斷和預(yù)后判斷提供理論依據(jù)，同時也對開發(fā)硒化合物治療宮頸癌具有重要意義?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

隨機(jī)選取2016年10月至2017年11月恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院住院的宮頸癌患者及同期住院的宮頸上皮內(nèi)腫瘤病人與其他宮頸良性疾病切除病人，均通過病理確診。每組病例各70例，年齡29～79歲，平均年齡45.1歲，中位發(fā)病年齡43歲；未絕經(jīng)143例，絕經(jīng)67例。收集宮頸癌患者宮頸癌組織和其他組患者的良性宮頸組織，一部分做成直徑約0.5 cm組織塊，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水包埋，制成0.4 μm切片備用，行常規(guī)染色及免疫組織化學(xué)染色觀察；剩余組織凍存于-80 ℃冰箱備用。上述所有研究對象在空腹8～12 h后，于清晨取肘靜脈血約5 mL，離心后取血清檢測血清硒含量。

1.2 主要儀器與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青-鏈霉素(P&S)、0.25%胰酶等均購自Gibco公司；SEBP1(SELENBP1)單抗( sc-373726)和內(nèi)參GAPDH抗體均購自美國 SANTA CRUZ 公司；c-Myc與p53一抗購自Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG二抗(Thermo公司)；免疫組化檢測試劑盒(三明安信)、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；生物安全柜(新加坡ESCO公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)(美國Bio Rad公司)；正置顯微鏡(日本尼康)；Amersham Imager 600 System (GE公司)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

1.3 檢測各組宮頸組織中蛋白表達(dá)

取多聚甲醛固定的各組宮頸組織，加入免疫組織化學(xué)染色(IHC)，采用鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化酶免疫組化(SP)法檢測，DAB顯色，一抗SEBP1的工作濃度為1∶400，一抗c-Myc為1∶200，p53為1∶1 000，操作流程按試劑說明書進(jìn)行。SEBP1、c-Myc、p53的表達(dá)以細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

1.4 蛋白免疫印跡

3×105細(xì)胞接種于6孔板中，NP40裂解細(xì)胞并提取總蛋白和BCA法蛋白定量；取20 g總蛋白上樣、SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜，一抗(稀釋比例均為1∶1 000)中4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。采用Amersham Imager 600 System觀察蛋白印跡條帶和成像；應(yīng)用Image J軟件半定量分析蛋白印跡條帶的積分光密度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者中血清硒含量與SEBP1含量情況

宮頸癌患者的血清中，其血清硒含量最低，為(46.6±14.3)μg/L，宮頸上皮內(nèi)腫瘤血清硒含量次之，為(61.3±12.1)μg/L，宮頸良性疾病患者的血清中硒含量最高，為(81.5±20.7)μg/L，宮頸癌患者的血清硒含量明顯低于宮頸上皮內(nèi)腫瘤和宮頸良性疾病的患者(P<0.05)(圖1)。

圖1 3組患者的血清硒含量比較注：與宮頸癌組比較，*P<0.05

2.2 3組患者組織中SEBP1表達(dá)量比較

3組病人組織陽性細(xì)胞SEBP1表達(dá)量中，宮頸癌患者、宮頸上皮內(nèi)腫瘤和宮頸良性疾病患者分別為(12.4±4.7)%、(18.5±5.8)%、(22.4±6.4)%，其中宮頸癌患者明顯低于宮頸上皮內(nèi)腫瘤和宮頸良性疾病的患者(P<0.05)(圖2)。

圖2 3組患者組織切片中SEBP1陽性細(xì)胞的比例注：與宮頸癌組比較，*P<0.05

2.3 不同細(xì)胞系中SEBP1蛋白的表達(dá)水平

與宮頸正常上皮細(xì)胞系H8相比，宮頸腫瘤細(xì)胞系Hela、SiHa和CaSki中，其SEBP1表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3WesternBloting檢測宮頸正常上皮細(xì)胞系H8以及宮頸腫瘤細(xì)胞系Hela、SiHa和CaSk中SEBP1的表達(dá)量

注：與H8比較，*P<0.05

2.4 宮頸癌進(jìn)展與SEBP1表達(dá)的關(guān)系

促癌基因c-Myc的陽性細(xì)胞比例與SEBP1陽性細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.364)，抑癌基因p53陽性細(xì)胞比例與SEBP1陽性細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.379)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 采用SP法檢測3組組織切片中SEBP1、c-Myc與抑癌基因p53的陽性細(xì)胞

2.5 SEBP1表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

SEBP1 Low組患者其復(fù)發(fā)率比例、淋巴轉(zhuǎn)移比例明顯高于SEBP1 High組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SEBP1 Low組患者其Ⅲ期或Ⅳ期的比例明顯高于SEBP1 High組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組的高分化和低分化比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 SEBP1 High組與SEBP1 Low組中復(fù)發(fā)率、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分期與分化程度比較[n(%),n=35]

3 討論

硒是許多生物過程必需和獨(dú)特的微量營養(yǎng)素，流行病學(xué)和臨床試驗研究[4]發(fā)現(xiàn)，膳食中硒缺乏與癌癥發(fā)病率增加有關(guān)，硒發(fā)揮其抗癌作用主要是通過影響具有營養(yǎng)價值的硒蛋白，目前已經(jīng)在人類基因組中至少鑒定了25個硒蛋白。硒蛋白廣泛參與細(xì)胞代謝，并且可能與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。SEBP1是硒蛋白家族的成員之一，其主要功能是介導(dǎo)硒的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。SEBP1在各種正常組織類型(肝、心、肺、腎)都有表達(dá)，其主要位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)中，與其相應(yīng)的正常組織相比，其表達(dá)在許多類型的癌癥中明顯降低，包括前列腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸和甲狀腺[6-7]。Epplein等[8]研究表明，人SEBP1在多種肺腺癌表現(xiàn)出表達(dá)降低。通過使用組合的蛋白質(zhì)組和基因組的方法分析發(fā)現(xiàn)，在大隊列中，人肺癌SEBP1的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)下降。而劉杰文等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SEBP1在乳腺腺病組織中呈高表達(dá)，而在乳腺癌組織中表達(dá)較低。本研究發(fā)現(xiàn)，與宮頸良性疾病患者相比，宮頸癌患者的組織切片中陽性細(xì)胞比例最低，宮頸上皮內(nèi)腫瘤陽性細(xì)胞的比例居中，宮頸良性疾病患者的陽性細(xì)胞比例最高。在宮頸癌細(xì)胞中，與正常宮頸上皮細(xì)胞相比，3株宮頸腫瘤細(xì)胞系中存在SEBP1低表達(dá)現(xiàn)象，這些結(jié)果說明SEBP1與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。

在癌癥的發(fā)生和預(yù)后中，SEBP1的下調(diào)可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。最近研究[10]表明，SEBP1可能與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥。隨著腫瘤分期的增加，SEBP1的表達(dá)降低，SEBP1水平也與細(xì)胞分化相關(guān)，低分化是晚期腫瘤階段的標(biāo)志。通過免疫組織化學(xué)評估SEBP1在結(jié)腸細(xì)胞分化的不同階段表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)腸細(xì)胞分化時，使用siRNA在Caco-2細(xì)胞中下調(diào)SEBP1的表達(dá)，結(jié)腸細(xì)胞系導(dǎo)致上皮分化標(biāo)志物癌胚抗原的表達(dá)也升高[11]。以上證據(jù)表明，SEBP1可能在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮功能。SEBP1具有抑制腫瘤的進(jìn)展作用，但基礎(chǔ)機(jī)制不清楚。Ying等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠中SEBP1的誘導(dǎo)抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步采用同量異位標(biāo)簽進(jìn)行相對和絕對定量分析，以鑒定參與SEBP1介導(dǎo)的腫瘤組織中抗癌作用的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SEBP1主要與MAPK、Wnt、NF-κB、NOTCH和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)信號通路相關(guān)。這些結(jié)果揭示了SEBP1抑制癌癥是通過多重信號通路的。在本研究中，促癌基因c-Myc和抑癌基因p53與SEBP1陽性明顯相關(guān)，c-Myc基因與p53基因是腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，調(diào)節(jié)多重信號通路[13]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，SEBP1表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系密切，SEBP1的高表達(dá)能降低宮頸癌的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，減小宮頸癌的惡性程度，從而提高宮頸癌預(yù)后。本研究結(jié)果再次證實了SEBP1在宮頸癌中的作用，為SEBP1作為臨床上腫瘤診斷與治療的標(biāo)志物提供了證據(jù)。

全面了解SEBP1抑制腫瘤的具體機(jī)制對提高SEBP1作為腫瘤治療的靶點(diǎn)具有重要意義。SEBP1可能發(fā)揮其腫瘤抑制作用，主要是作為腫瘤氧化還原微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑，因為SEBP1的表達(dá)降低可能影響谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPX1)活性和HIF-1α表達(dá)[14]。去泛素化酶1(VDU1)是最近發(fā)現(xiàn)的SEBP1的另一個重要調(diào)節(jié)因子，能夠參與泛素化或去泛素化，介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解途徑[15]。一些研究人員[16]注意到，SEBP1表達(dá)可導(dǎo)致脂質(zhì)/葡萄糖代謝相關(guān)蛋白變化，如Dickkopf相關(guān)蛋白1(DKK1)，膜聯(lián)蛋白A4(ANXA4)和核因子κB(NF-κB)，并且這些分子能通過調(diào)節(jié)下游分子抑制致癌作用和腫瘤進(jìn)展。此外，研究[17-18]顯示，SEBP1與GPX1相互作用，并且降低GPX活性。因為GPX1是分解過氧化氫的硒酶，所以SEBP1可以通過改變氧化應(yīng)激發(fā)揮抑制腫瘤的作用。在宮頸癌中不存在或存在過氧化氫處理的情況下，Hela細(xì)胞中敲低SEBP1的表達(dá)，能降低活性氧(ROS)水平。這種抑制的氧化應(yīng)激可歸因于GPX1，因為SEBP1能下降GPX酶活性[19]，并且敲低SEBP1，增加GPX1蛋白表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與預(yù)后[20]。目前關(guān)于癌癥發(fā)生過程中，ROS、SEBP1和抗氧化硒蛋白之間的相互作用并不清晰，本研究揭示了SEBP1對宮頸癌發(fā)生發(fā)展與預(yù)后的作用，但機(jī)制并未闡明，因此需要進(jìn)一步的機(jī)制研究。

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