張玉明 楊 振 劉利敏 段夢(mèng)露 張 磊 孫世仁

我國(guó)慢性腎臟病患者約有1.2億，其中成人患病率為10.8 %[1]，慢性腎臟病已經(jīng)成為危害公眾健康的嚴(yán)重問(wèn)題。腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種慢性腎病進(jìn)行性發(fā)展的共同途徑，是形成終末期腎衰竭(ESRF)的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[2-4]。然而RIF的機(jī)制并不十分清楚，缺乏有效的治療手段，闡明RIF機(jī)制成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

研究表明，腎小管上皮細(xì)胞能量代謝障礙是形成腎臟纖維化的危險(xiǎn)因素之一[5]。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場(chǎng)所，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能缺陷與腎臟纖維化的發(fā)病有關(guān)[6-10]；線粒體中α酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(α-KGDHC)是三羧酸循環(huán)氧化脫羧的限速酶，二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(DLST)定位于線粒體，參與細(xì)胞的能量代謝，是α-KGDHC的重要組成部分[11]。本研究采用小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型和HK2細(xì)胞缺氧模型，探討DLST在腎臟纖維化中的作用。

材料與方法

材料8周齡雄性C57b/l小鼠，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食及飲水，在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。兔抗人DLST多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體和兔抗人α-SMA多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森，lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自GIBCO公司，DLST高表達(dá)質(zhì)粒和DLST shRNA購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司。

方法

動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組(Sham，n=15)和UUO模型組(n=45)，UUO模型組又隨機(jī)分為1周(n=15)、2周(n=15)和3周組(n=15)。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg,30 g/L)，麻醉后正中切口，逐層暴露腎臟，游離左側(cè)輸尿管，穿線結(jié)扎并剪斷左側(cè)輸尿管，逐層縫合切口。Sham組只暴露腎臟，游離左側(cè)輸尿管，穿線但不結(jié)扎和剪斷，其余操作與模型組相同。小鼠麻醉蘇醒后正常飼養(yǎng)。

HE和Masson染色 分別于術(shù)后即刻、1周、2周和3周處死小鼠，取左側(cè)腎臟，用生理鹽水沖洗，放入4%甲醛溶液中固定48h，常規(guī)石蠟包埋，切片，行HE和Masson染色。

免疫組化檢測(cè)DLST的表達(dá) 將固定好的腎組織脫水復(fù)蠟，包埋后切片；切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，用3% H2O2去離子水孵育10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；PBS浸泡5 min；10%山羊血清室溫孵育30 min；滴加兔抗大鼠DLST一抗4℃過(guò)夜后，37℃再孵育2 h，PBS洗3遍；滴加羊抗兔IgG二抗，37℃孵育2 h，PBS洗3遍；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液，37℃孵育30 min，PBS洗3遍；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片；普通光鏡下觀察。

Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組小鼠腎臟組織，提蛋白取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量；各組取相同蛋白量經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5 %脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，然后用DLST、Col-Ⅰ、α-SMA(1∶ 1 000)和β-actin(1∶ 5 000)的一抗4℃過(guò)夜；TBST洗膜3次，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，TNST洗膜3次；ECL顯色，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參。

細(xì)胞培養(yǎng) HK2細(xì)胞用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基在恒溫37℃，95% O2/5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，缺氧組HK2細(xì)胞先將培養(yǎng)基更換為不含10%胎牛血清的DMEM，然后將培養(yǎng)瓶置于含1% O2和5% CO2的培養(yǎng)箱中缺氧12 h，缺氧完成后更換培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM，并在95% O2/5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧4h。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 嚴(yán)格按照上海吉?jiǎng)P公司高表達(dá)質(zhì)粒和shRNA的步驟操作。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明將DLST高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，Western Blot檢測(cè)Col-Ⅰ表達(dá)的變化；按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)染Control siRNA和3種不同的DLST shRNA，培養(yǎng)48h后，Western Blot檢測(cè)Col-Ⅰ表達(dá)的變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用單因素方差分析比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各組小鼠腎臟組織的病理變化小鼠腎臟HE染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管和腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；UUO組小鼠在1、2、3周時(shí)腎小管損傷明顯，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腫脹，腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨著模型時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷逐漸加重。Masson染色結(jié)果顯示，Sham組小鼠腎間質(zhì)沒(méi)有明顯的染藍(lán)膠原纖維；UUO組小鼠在1、2、3周時(shí)腎間質(zhì)可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維，且隨著模型時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維化程度逐漸增加(圖1)。

圖1 單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟纖維化和損傷明顯(A～D：HE，×400；E～H：Masson，×400)

各組小鼠腎臟DLST免疫組化的比較Sham組小鼠腎臟DLST免疫組化染色可見(jiàn)大量的棕黃色顆粒，且分布廣泛，說(shuō)明DLST在Sham組表達(dá)較多；而與Sham組相比，UUO模型組小鼠腎臟在1、2、3周時(shí)均可見(jiàn)DLST的表達(dá)顯著減少，而且隨著模型時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸降低(圖2)。

圖2 單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)逐漸減少(IH，×400)

各組小鼠腎臟DLST、Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)的變化Western-Blot結(jié)果檢測(cè)DLST、Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，與Sham組相比，UUO組DLST的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低(P<0.05)，而Col-Ⅰ和α-SMA的表達(dá)逐漸增加(P<0.05)，表明纖維化程度隨著UUO模型時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加重(圖3)。

HK2細(xì)胞高表達(dá)和干擾DLST后Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)的變化Western blot結(jié)果顯示，在高表達(dá)DLST時(shí)，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，缺氧條件下高表達(dá)DLST可明顯增加其蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)顯著抑制纖維化相關(guān)蛋白Col-Ⅰ的表達(dá)；而在正常HK2細(xì)胞，與NC組相比，用3種不同DLST的shRNA沉默DLST，3種shRNA均能降低DLST的蛋白表達(dá)，其中shRNA2和3的沉默作用更明顯，同時(shí)3種shRNA沉默DLST后，Col-Ⅰ的表達(dá)顯著升高，其中shRNA2和3升高的更明顯(圖4)。

圖3 單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟DLST表達(dá)降低而纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)增加Sham:假手術(shù)組；DLST：二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶；Col-Ⅰ：Ⅰ型膠原蛋白；α-SMA:α平滑肌動(dòng)蛋白；*：與Sham組比較，P<0.05; **：與Sham組比較，P<0.01

圖4 HK2細(xì)胞缺氧時(shí)高表達(dá)DLST可減少Col-Ⅰ表達(dá)Col-Ⅰ:Ⅰ型膠原蛋白；DLST：二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶；與對(duì)照組比較*：P<0.05;**：P<0.01

討 論

腎間質(zhì)纖維化是由多種因素引起的細(xì)胞外基質(zhì)成分在腎間質(zhì)內(nèi)過(guò)度聚集和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生形成的一種慢性病理性變化，是各種慢性腎臟病發(fā)展到終末期的共同結(jié)果[12-15]。然而腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，缺乏有效的臨床治療藥物，因此，闡明腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制，探索有效的治療方法，對(duì)于防治和治療各種慢性腎病具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，UUO模型組小鼠腎小管損傷明顯，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腫脹，腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而且Masson染色顯示纖維化增加明顯，損傷和纖維化程度均隨著模型時(shí)間的延長(zhǎng)而加重；同時(shí)，我們又觀察了纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UUO模型組Col-Ⅰ和α-SMA的表達(dá)顯著增加，這些結(jié)果提示UUO模型出現(xiàn)了明顯的腎間質(zhì)纖維化。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，線粒體能量代謝障礙是導(dǎo)致腎臟損傷的一個(gè)重要因素，DLST是線粒體三羧酸循環(huán)氧化脫羧限速酶α-KGDHC的重要組成部分[16]，其在腎臟損傷中的作用也越來(lái)越受到關(guān)注。免疫組化和Western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UUO模型組DLST的表達(dá)顯著減少。這些結(jié)果提示DLST可能與腎間質(zhì)纖維化的形成有關(guān)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證DLST在腎間質(zhì)纖維化形成中的作用，我們采用HK2細(xì)胞缺氧模型模擬纖維化過(guò)程。結(jié)果顯示，缺氧處理后高表達(dá)DLST可明顯降低纖維化相關(guān)蛋白Col-Ⅰ的表達(dá)，而正常HK2細(xì)胞用shRNA干擾DLST后，可明顯增加Col-Ⅰ蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果證明DLST表達(dá)的變化可直接影響纖維化的進(jìn)程。由于DLST是α酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的重要組成部分，參與三羧酸循環(huán)能量代謝的調(diào)控。缺氧時(shí)，三羧酸循環(huán)受阻可能是導(dǎo)致DLST表達(dá)降低的原因。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UUO模型小鼠腎臟腎間質(zhì)纖維化程度加重，同時(shí)伴有DLST蛋白表達(dá)的降低。而DLST表達(dá)的變化可直接影響纖維化的進(jìn)程。這為臨床上治療腎間質(zhì)纖維化提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和策略。然而DLST表達(dá)改化參與腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

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