王曉楠 徐婷婷 趙婷婷 秦衛(wèi)松

近年來糖尿病的發(fā)病率顯著增加。糖尿病腎病(DN)已經(jīng)成為中國繼腎小球腎炎之后引起終末期腎病的第二大因素[1]。多種因素參與了DN的發(fā)病和進(jìn)展，包括環(huán)境因素、基因背景以及表觀遺傳修飾等，其中表觀遺傳修飾近年來逐漸受到了關(guān)注和重視[2-6]。常見的表觀遺傳學(xué)修飾包括：DNA甲基化、組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾及非編碼RNA等[4]。其中，DNA甲基化是目前研究最廣泛的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一[7-8]，是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子接受一個甲基，被修飾為5-甲基胞嘧啶[8]。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象和穩(wěn)定性、DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而調(diào)控基因表達(dá)。

已有研究表明，與糖尿病非腎病患者相比，DN患者基因組甲基化整體水平存在差異[9]，其中一些CpG位點(diǎn)甲基化水平的改變與DN的關(guān)系密切，表明DNA甲基化對DN的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。 但目前有關(guān)DN的DNA甲基化機(jī)制的研究所采取的標(biāo)本主要是唾液或外周血單個核細(xì)胞DNA[10-11]。由于表觀遺傳機(jī)制具有明顯的細(xì)胞特異性，有關(guān)DN腎組織和腎臟固有細(xì)胞的甲基化研究將更有利于揭示DNA甲基化參與DN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

研究對象和方法

研究對象

納入標(biāo)準(zhǔn)及分組 分為DN組、糖尿病非腎病組(DM組)和正常對照組，每組各3例。DN組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合WHO 1999年糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)經(jīng)腎活檢符合DN的病理特點(diǎn)。DM組選取在南京總醫(yī)院泌尿外科因腎臟腫瘤接受腎摘除手術(shù)的腎功能正常且微量白蛋白尿<30 μg/mg的2型糖尿病患者，留取癌旁腎組織。正常對照組選取因腎臟腫瘤在南京總醫(yī)院泌尿外科接受腎摘除手術(shù)的血糖正常患者，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查排除糖尿病、腎臟疾病及其他系統(tǒng)疾病，留取癌旁腎組織。所有受試者均為漢族人，彼此之間無親緣關(guān)系。

排除標(biāo)準(zhǔn) 排除其他內(nèi)分泌疾病、肝膽疾病、慢性腎炎、泌尿系感染、原發(fā)性高血壓病等疾??；且在近期無糖尿病酮癥酸中毒及其他急性并發(fā)癥，無腎損害藥物用藥史。

主要試劑及儀器

試劑 TruSeq?DNA LT Sample Prep Kit v2(Illumina)；TruSeq PE Cluster Kit(Illumina)；TruSeq SBS Kit(Illumina)；DNA微量提取試劑盒(Qiagen)；亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(Qiagen)等。

儀器 Hisq3000 高通量測序儀(Illumina)；CBOT 簇生成儀(Illumina)；冷凍離心機(jī)(Scan speed)；濃縮儀 (Thermo)；常溫離心機(jī)(Thermo)等。

全基因組甲基化測序

腎組織DNA制備 取腎組織25 mg，切成小塊狀，置于離心管中，加入蛋白酶K 10 μl，56℃過夜孵育，按照DNA微量提取試劑盒(Cat#56304，QIAGEN，Germany)說明書，提取DNA。

DNA質(zhì)檢 取1 μl DNA使用熒光定量儀進(jìn)行定量，根據(jù)定量結(jié)果，取50 ng DNA進(jìn)行電泳檢測，結(jié)束后在紫外透射光下觀察。合格樣本電泳結(jié)果為單一條帶；如出現(xiàn)條帶拖尾或彌散，說明DNA樣本有降解，完整性不佳；如有雜帶，說明含其他雜質(zhì)。

WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing)文庫構(gòu)建 取2.2 μg DNA(14 μl)，用緩沖液稀釋至86 μl，用超聲使DNA 片段化，大小在200～500 bp；用末端修復(fù)緩沖液將DNA 末端補(bǔ)平；加A尾緩沖液至DNA中；加入連接緩沖液、接頭，充分混勻；用2%的瓊脂糖凝膠電泳篩選250～350 bp的DNA，按照膠回收試劑盒(Cat#28604，QIAGEN，Germany)對DNA進(jìn)行回收；將回收到的DNA按照亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(Cat#59104，QIAGEN，Germany)說明書對DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理；最后進(jìn)行PCR富集，使用熒光定量儀定量WGBS文庫。

簇生成 將WGBS文庫稀釋至10 nmol/L；取4 μl 10 nmol/L文庫，加1 μl 2 nmol/L NaOH，加15 μl Tris·Cl，混勻，室溫放置5 min；取出6 μl，加入994 μl冷的雜交緩沖液；取140 μl上述溶液，放在八連管中，置于cBot的template欄中(cBot為成簇的儀器，template為成簇儀上面的放八連管的架子)；開始簇生成。

Illumina Hiseq3000測序 使用Hiseq3000上機(jī)測序；將得到的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成 Fastq格式；數(shù)據(jù)質(zhì)量達(dá)到 Q30>80%(Q30為堿基質(zhì)量評估值，指每個堿基錯誤的可能在1/1 000，所有質(zhì)量達(dá)到Q30的堿基占總堿基量的80%)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行比較，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

DN患者腎組織DNA的CpG甲基化水平升高所有樣本的DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，未被甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃD(zhuǎn)化率均>99.92%；經(jīng)全基因組甲基化測序一共得到604 829 312～1 029 008 460條原始序列數(shù)，去除低質(zhì)量片段后，得到589 964 228～1 012 361 576條序列數(shù)，占原始序列數(shù)的比例為96.50%～98.38%。所有樣本的唯一比對率為66.17%～78.00%。DN患者腎組織DNA的CpG甲基化水平為72.32±0.58%，高于糖尿病非腎病患者(71.84±0.92%)和正常對照(71.70±0.90%)。

DN患者腎組織DMR分析差異甲基化區(qū)域(differentially methylated regions，DMR)是指在多種樣本(組織、細(xì)胞、個體等)中基因組里甲基化狀態(tài)不相同的區(qū)域，是參與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的功能性區(qū)域。DMR的判定條件：該區(qū)域中甲基化有差異的C堿基占總C堿基的比例大于50%；長度大于50 bp；DMR區(qū)域內(nèi)至少含5個C堿基。根據(jù)全基因組甲基化測序的結(jié)果，篩選得到DN患者腎組織的DMR，在染色體的分布情況如圖1所示?？梢奃MR在每條染色體上均有分布，在每條染色體上，DN患者與糖尿病非腎病患者之間的DMR數(shù)目均高于這兩組患者與正常對照之間的DMR數(shù)目。

圖1 DN患者腎組織DMR在各染色體的分布DMR:差異甲基化區(qū)域；DM：糖尿病非腎病組；DN：糖尿病腎病組；NC：正常對照組

將DN組與DM組進(jìn)行比較，得到13 247個DMR，關(guān)聯(lián)到7 379個差異甲基化基因(DMR-related genes，DMG)。其中，DN患者有10 802個DMR、6 246 個DMG的甲基化水平明顯高于糖尿病非腎病患者；2 445個DMR、1 133個DMG的甲基化水平明顯低于糖尿病非腎病患者(表1)。

表1 三組患者腎組織DMR甲基化水平的變化

DMR:差異甲基化區(qū)域；DN：糖尿病腎病組；DM：糖尿病非腎

病組；NC：正常對照組；DMG：差異甲基化基因

DMR關(guān)聯(lián)基因分析對DN組與DM組比較得到的13 247個DMR關(guān)聯(lián)的7 379個DMG進(jìn)行差異基因功能分類注釋(GO)分析，富集到14 119條GO條目，其中2 190條GO條目有顯著差異(P<0.05)(圖2)。差異基因生物學(xué)路徑(KEGG)分析得到267條通路，其中有87條通路顯著富集(P<0.05)，包括局灶黏連，黏合連接，MAPK 信號通路等。

圖2 糖尿病腎病組與糖尿病非腎病組差異基因的GO分析結(jié)果

對富集于局灶黏連通路的DMG進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一些整合素基因的甲基化水平在DN患者和糖尿病非腎病患者中存在顯著差異(表2)。

DMR和DMG的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫DN腎組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)(GSE30122)[12]， 分析得到DN患者的差異表達(dá)基因。將差異表達(dá)基因和由DNA甲基化表達(dá)譜得到的DMG進(jìn)行聯(lián)合分析，探索DNA的甲基化水平和基因的表達(dá)水平之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有90個DMR關(guān)聯(lián)到的62個差異基因的甲基化水平和表達(dá)水平之間存在負(fù)相關(guān)，這些基因包括ARHGAP28、FOXC1、ITGA8、NEU1、COL4A3、FLT1、LAMA1、MYLK3、FGF9、MYC等。

在這些負(fù)相關(guān)的基因里，62個基因富集到49條GO條目，其中24條GO條目差異顯著(P<0.05)。包括肌動蛋白細(xì)胞骨架，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成等。另外，有28個基因富集到9條KEGG通路，其中7條通路有顯著差異(P<0.05)，包括局灶黏連，PI3K-Akt信號通路，細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用等。Fms樣酪氨酸激酶1(fms related tyrosine kinase 1，F(xiàn)LT1)顯著富集于局灶黏連(P=0.001)和PI3K-Akt信號通路(P=0.002)。

表2 DN患者與DM患者整合素基因甲基化水平的比較

DN：糖尿病腎病組；DM：糖尿病非腎病組；ITGA2B/6/7/8/11：整合素α 2B/6/7/8/11；ITGB4/5/6/7：整合素β 4/5/6/7；*：數(shù)據(jù)用

均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示

討 論

近年來表觀遺傳修飾參與DN的發(fā)病機(jī)制逐漸受到關(guān)注和重視，已有一些研究利用DN患者外周血白細(xì)胞或唾液細(xì)胞DNA，通過甲基化芯片檢測的方法，發(fā)現(xiàn)高糖微環(huán)境導(dǎo)致的DNA甲基化改變在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10-11,13-14]，但有關(guān)DN患者腎組織DNA甲基化譜的研究，目前尚未見報(bào)道。

CpG島是基因的一種重要標(biāo)志，參與基因表達(dá)的調(diào)控，影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，正常細(xì)胞CpG島由于被保護(hù)而處于非甲基化狀態(tài)[15]。本研究通過對DN患者腎組織進(jìn)行全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，DN患者的整體CpG甲基化水平高于DM組和正常對照組，這和Maghbooli等[9]的研究結(jié)果相似。

DMR是指基因組里甲基化狀態(tài)不相同的區(qū)域，可通過改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)或者轉(zhuǎn)錄效率來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。利用全基因組甲基化數(shù)據(jù)，我們進(jìn)一步對DMR進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DN患者與糖尿病非腎病患者之間的DMR數(shù)目明顯高于這兩組患者與正常對照之間的DMR數(shù)目，表明眾多DMR參與了DN發(fā)生發(fā)展的過程。與DM組相比，DN患者大部分DMR呈現(xiàn)高甲基化水平；與正常對照組相比，糖尿病非腎病患者的大部分DMR也呈現(xiàn)高甲基化，進(jìn)一步表明DNA的甲基化改變參與糖尿病和DN的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，DN組與DM組比較得到的DMG主要和局灶黏連、黏合連接、MAPK 信號通路有關(guān)。局灶黏連作為細(xì)胞和外界環(huán)境的機(jī)械連接和生物信號中心，在整合蛋白綁定和聚集處集中并引導(dǎo)許多信號蛋白質(zhì)。有文章報(bào)道ITGA11在CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型以及人類肝纖維化患者中表達(dá)上調(diào)[16]，同時敲除ITGA11 可以顯著減少TGFβ誘導(dǎo)的α-SMA的分化和collagen-I等細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。另有研究表明整合素拮抗劑可減少糖尿病腎病大鼠模型中蛋白尿和腎纖維化的情況[17]。本研究中，整合素家族基因ITGA11、ITGA2B、ITGA6、ITGA7、ITGA8、ITGB4、ITGB5、ITGB6和ITGB7的甲基化水平在DN組和DM組之間均有顯著差異。而在先前的相關(guān)研究中，Sapienza等[11]曾利用基因芯片對糖尿病腎病患者唾液DNA中27578個CpG位點(diǎn)進(jìn)行甲基化分析，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITGB4、ITGB6、ITGB8等基因的多個CpG位點(diǎn)存在顯著差異。本結(jié)果與之類似。進(jìn)一步表明整合素基因甲基化水平的改變在DN的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

DNA的甲基化對基因表達(dá)水平發(fā)揮重要的調(diào)控作用，啟動子區(qū)域的甲基化對于基因的表達(dá)有重要影響。通常情況下，啟動子區(qū)DNA甲基化水平增加，可通過阻斷轉(zhuǎn)錄起始因子與啟動子的結(jié)合直接抑制基因轉(zhuǎn)錄；可招募甲基化CpG結(jié)合蛋白，與5-甲基胞嘧啶結(jié)合后，進(jìn)一步阻礙轉(zhuǎn)錄起始因子與啟動子結(jié)合；還可招募組蛋白去乙?；感纬蓮?fù)合物，使組蛋白去乙酰化，導(dǎo)致染色質(zhì)聚縮成非活性致密結(jié)構(gòu)，間接抑制基因轉(zhuǎn)錄；而啟動子區(qū)DNA甲基化水平降低則會導(dǎo)致基因表達(dá)的增加[18-19]。

GSE30122采用的是人腎組織。其中DN患者取其腎活檢組織。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合糖尿病的診斷，有蛋白尿，GFR<60 ml/min，組織學(xué)改變符合DN的特點(diǎn)；排除肝炎、狼瘡及其他可引起腎炎的因素。正常對照選取移植腎或腎腫瘤切除術(shù)后的癌旁腎組織。入選標(biāo)準(zhǔn)：GFR>60 ml/min，無蛋白尿，血清肌酐、尿素氮正常，腎小球及腎小管間質(zhì)纖維硬化<10%。利用激光微分離技術(shù)將腎組織切割為腎小管或腎小球。GSE30122包括三個系列，分別為：GSE30528為腎小球的測序結(jié)果，包括9例DN和13例正常對照；GSE30529 為腎小管的測序結(jié)果，包括10例DN和12例正常對照；GSE30566 為正常對照的13例腎小球和12例腎小管之間的測序結(jié)果。而我們的數(shù)據(jù)分析，是按疾病狀態(tài)進(jìn)行分組，即僅進(jìn)行DN患者(包括腎小管和腎小球兩部分的數(shù)據(jù))和正常對照之間的比較，對于腎小球和腎小管之間不做差異表達(dá)基因的相關(guān)分析。

DMG和差異表達(dá)基因聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，62個差異基因的甲基化水平和表達(dá)水平之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，且這些差異基因顯著富集到局灶黏連和PI3K-Akt信號通路。其中包括FLt-1，其為血管內(nèi)皮生長因子的特異性受體，二者結(jié)合可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，造成血漿蛋白外滲。足細(xì)胞Flt-1表達(dá)減少，會導(dǎo)致足細(xì)胞的細(xì)胞骨架重構(gòu)，引起足突融合，使腎小球的濾過屏障受損，進(jìn)一步導(dǎo)致大量蛋白尿和腎功能衰竭。在我們的研究結(jié)果中，F(xiàn)lt-1的甲基化水平在DN患者和正常對照中存在顯著差異，進(jìn)一步表明DNA甲基化在DN的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

小結(jié)：本研究利用全基因組甲基化測序技術(shù)，首次建立了DN患者腎組織的DNA甲基化表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)DN患者的整體CpG甲基化水平明顯高于糖尿病非腎病患者，DN患者腎組織的DMR數(shù)目增加，關(guān)聯(lián)的差異基因的甲基化水平和mRNA表達(dá)水平之間存在負(fù)相關(guān)，表明DNA甲基化在DN的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，為DN發(fā)病機(jī)制的研究提供了新思路。

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