張利文 施少林 侯 慶 汪 玲 張明超 任 強(qiáng) 諶達(dá)程 李 知 翟修文秦衛(wèi)松 曾彩虹 陳朝紅 劉志紅

足細(xì)胞損傷是局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)等多種腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的病理主因，足細(xì)胞凋亡和脫落導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少和毛細(xì)血管塌陷[1]，被認(rèn)為是FSGS的發(fā)展的重要步驟。但足細(xì)胞凋亡和缺失的分子機(jī)制尚不明確。

生長(zhǎng)抑制與DNA損傷基因45β(GADD45B)在DNA損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞周期、凋亡和生存調(diào)節(jié)[2]。Shi等[3]發(fā)現(xiàn)，GADD45B在Dicer缺失小鼠腎小球足細(xì)胞特異表達(dá)。足細(xì)胞Dicer缺失導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡和脫落，與小鼠蛋白尿和腎小球硬化進(jìn)展有關(guān)。Zhang等[4]發(fā)現(xiàn)脂多糖可誘導(dǎo)GADD45B mRNA表達(dá)上調(diào)，在機(jī)體主要臟器組織中，腎和脾GADD45B mRNA表達(dá)量最高。Pippin等[5]研究發(fā)現(xiàn)，GADD45B蛋白表達(dá)水平在進(jìn)展性Heymann腎炎大鼠腎小球和C5b-9處理培養(yǎng)的足細(xì)胞中增加。 但是，目前尚不清楚GADD45B表達(dá)升高是否在足細(xì)胞損傷中起直接作用。本研究觀察GADD45B在腎小球表達(dá)，探索其表達(dá)改變對(duì)足細(xì)胞功能的影響。

材料與方法

病例選擇隨機(jī)選擇南京總醫(yī)院國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心經(jīng)腎活檢證實(shí)為FSGS的患者37例，入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)蛋白尿>3.5 g/24h; (2)血清肌酐(SCr)<265.2 μmol/L;(3)排除有明確繼發(fā)因素(感染、藥物、代謝、腫瘤等)，無(wú)腎病家族史。腎癌旁組織8例(我院泌尿外科腎癌切除患者)作為正常對(duì)照。本研究中的腎組織樣本來(lái)源于國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心生物樣本庫(kù)，經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

臨床病理指標(biāo)的相關(guān)分析分別將24h尿蛋白、SCr、血清白蛋白(Alb)與FSGS腎小球GADD45B累積光密度進(jìn)行pearson相關(guān)性分析。

腎小球組織處理和分離患者腎活檢組織置于RNA保存液中(Ambion)在-70℃保存。將活檢腎組織放入4℃ RNA保存液中，于顯微鏡下手持解剖鑷分離腎小球。分離的腎小球進(jìn)行RNA提取(Qiagen)，cDNA合成(Invitrogen)及qRT-PCR(Qiagen)。GADD45B引物正義鏈:5′-CTGGTCACGAACCCTCACACGG-3′,反義鏈：5′-TTGCCCCGGCTTCTTCGCA-3′。 內(nèi)參引物18S RNA正義鏈:5′-GATGGGCGGCGGAAAATAG-3，反義鏈： 5′-GCGTGGATTCTGGATAATGGT-3′。

免疫組織化學(xué)染色與分析將甲醛固定石蠟包埋切片(2 μm)，經(jīng)脫蠟，抗原修復(fù)和封閉后，與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記兔抗人GADD45B抗體(1∶ 50) ，4℃過(guò)夜孵育。經(jīng)DAKO EnVision系統(tǒng)孵育(Dako)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染； AP標(biāo)記抗體以BCIP/NBT顯色；光鏡下觀察。每張切片在400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)非重疊完整腎小球，以Image-Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)腎組織免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，計(jì)算每個(gè)腎小球累積光密度(integrated optical density，IOD)。

斑馬魚飼養(yǎng)和繁殖斑馬魚飼養(yǎng)于28.5℃水溫環(huán)境中，照明14h與黑暗10h交替。斑馬魚胚胎于28．5℃培養(yǎng)箱中孵化，每日更換培養(yǎng)液。

轉(zhuǎn)基因斑馬魚構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚系Tg(pod:Gal4),Tg(UAS:GADD45Ba,cmlc2:gfp)和Tg(UAS:GADD45Bb,cmlc2:gfp)利用Tol2轉(zhuǎn)座子和Tol2門克隆技術(shù)試劑盒(Kwan,Fujimoto et al.2007)構(gòu)建。斑馬GADD45Ba/bb cDNA 利用RT-PCR從斑馬魚胚胎擴(kuò)增所得，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pME-MCS并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。所用引物如下GADD45Ba 正義鏈：5′-TTGGTACCATGACCCTGGAAGAAGTCGTTG-3′,反義鏈： 5′-AGAATTCTCAGCGTTCTTGCAGGGACAG-3′； gadd45bb 正義鏈：5′-TTGGTACCATGACTCTGGAGGAAGTTGTTG-3′,反義鏈： 5′-AGAATTCTCAGCGCTCTTGCAGG-3′。 中間克隆,p5E-UAS 和 p3E-cmlc2:EGFP-pA用LR酶根據(jù)廠商操作步驟組合而成(Life Technology)。表達(dá)載體與Tol2轉(zhuǎn)座酶RNA，共同注入單細(xì)胞期野生型(AB)斑馬魚胚胎。為鑒定Tg(UAS:GADD45Ba:cmlc-gfp) 和 (UAS:gadd45bb:cmlc-gfp)轉(zhuǎn)基因魚,將轉(zhuǎn)基因魚與AB斑馬魚交配,F1胚胎(72 hpf)置于熒光顯微鏡下觀察。將心臟有綠色熒光的配體喂養(yǎng)至成年。Tg(pod:GAL4) F1斑馬魚和Tg(UAS:NTR-mcherry)斑馬魚交配產(chǎn)卵，將腎臟有mcherry紅色熒光的斑馬魚養(yǎng)至成年即獲得雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(pod:GAL4;UAS:NTR-mcherry)。Tg(UAS:NTR-mcherry) 來(lái)自國(guó)際斑馬魚資源庫(kù)(ZIRC)。

反義寡核苷酸(Morpholino，MO)實(shí)驗(yàn)Splice MO是一種反義嗎啉寡核苷酸，可以干擾mRNA正常剪切，從而降低該基因的表達(dá)。在剪切的兩端設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR分別行產(chǎn)物電泳和條帶切膠回收基因測(cè)序。如有序列的缺失或者插入，PCR產(chǎn)物凝膠電泳會(huì)出現(xiàn)雙條帶。GADD45Ba/bb的MO購(gòu)自GENE TOOLS公司。序列如下GADD45Ba (Exon 3 )5′-TGTATGTGTCTACTTACAGTGACGA-′3.GADD45Bb (Exon 3) 5′-ATCCCTGAAGAAGTTGACAAACGCA-′3，對(duì)照MO:5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-′3。斑馬魚單細(xì)胞期胚胎進(jìn)行注射0.6 mmol/L GADD45Ba MO或1.5 mmol/L GADD45Bb MO。所使用的鑒定引物為gadd45 ba正義鏈： 5′-TTGGTACCATGACCCTGGAAGAAGTCGTTG-3′,反義鏈:5′-AGAATTCTCAGCGTTCTTGCAGGGACAG-3′。GADD45Bb正義鏈：5′ TTGGTACCATGACTCTGGAGGAAGTTGTTG-3′,反義鏈： 5′- AGAATTCTCAGCGCTCTTGCAGG -3′。

誘導(dǎo)斑馬魚足細(xì)胞損傷Tg(pod:GAL4;UAS:NTR-mcherry) 斑馬魚足細(xì)胞過(guò)表達(dá)硝基還原酶(NTR),可將甲硝唑(MTZ)轉(zhuǎn)化為毒性物質(zhì)，從而誘導(dǎo)足細(xì)胞的損傷[6]。MTZ作用于72 hpf斑馬魚胚胎48h， 0.1% DMSO作為溶劑對(duì)照。

原位雜交胚胎用含4%多聚甲醛(PFA)磷酸鹽緩沖液(PBS)固定，用地高辛標(biāo)記的GADD45B RNA探針在70°雜交，然后用連接堿性磷酸酶標(biāo)記的底物抗地高辛抗體孵化，硝基四氮唑藍(lán)(NBT)顯色。

凋亡檢測(cè)抗caspase-3蛋白抗體(BD Biosciences)1∶ 500稀釋，抗Cy3標(biāo)記二抗(Invitrogen)抗體1∶ 2 000稀釋，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察拍攝( SP53，Leica)。

蛋白尿檢測(cè)Tg(pod:NTRmCherry;l-fabp:VDBP-GFP)與Tg(UAS:GADD45Ba/bb)交配產(chǎn)卵，將20枚3 dpf胚胎放入12孔板中， MTZ處理12h，取100 μl培養(yǎng)液，ELISA定量檢測(cè)幼魚中培養(yǎng)基中綠色熒光蛋白(GFP)(Cell Biolabs,San Diego,CA)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 軟件(version 11.5)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

GADD45B在FSGS患者腎小球中表達(dá)上調(diào)qRT-PCR顯示，F(xiàn)SGS患者腎小球GADD45 mRNA表達(dá)顯著高于正常組(圖1A)。免疫組化染色顯示，GADD45B信號(hào)在正常腎組織腎小球很弱，在FSGS患者腎小球，GADD45B表達(dá)顯著增加(圖1C)，F(xiàn)SGS組IOD為3 807.20±2 069.80；正常對(duì)照組：979.08±202.82(圖1B)。

圖1 GADD45B在FSGS患者腎小球中表達(dá)上調(diào)A：分離人腎小球RNA的實(shí)時(shí)熒光定量qPCR結(jié)果；B：免疫組化染色半定量分析結(jié)果；C：免疫組化染色，C1-2,C4-5:DAB 顯色；C3,C6:BCIP/NBT顯色；FSGS：局灶節(jié)段性腎小球硬化；IOD：累積光密度

FSGS患者GADD45B表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性pearson相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)SGS患者腎小球GADD45B表達(dá)與蛋白尿呈正相關(guān)(r=0.667，P<0.01)(圖2A)，與Alb呈負(fù)相關(guān)(r=-0.371，P<0.05)(圖2B)，與SCr呈正相關(guān)(R=0.361，P<0.05)(圖2C)。

圖2 FSGS患者腎小球GADD45B表達(dá)量與臨床指標(biāo)的相關(guān)性A：GADD45B表達(dá)量與蛋白尿呈正相關(guān)；B：與Alb呈負(fù)相關(guān)；C：與SCr呈正相關(guān)；SCr:血清肌酐；Alb血清白蛋白；I0D：累積光密度

GADD45B在斑馬魚足細(xì)胞上表達(dá)GADD45B在斑馬魚的同源基因?yàn)镚ADD45Ba和GADD45Bb。利用qRT-PCR對(duì)分離斑馬魚足細(xì)胞并進(jìn)行純度驗(yàn)證，結(jié)果顯示分離下的腎小球組織只表達(dá)足細(xì)胞標(biāo)記分子podocin而不表達(dá)腎小管標(biāo)記分子cdh17(圖3A)。 RT-PCR結(jié)果顯示GADD45B和在斑馬魚腎小球上有表達(dá)(圖3B)。

圖3 斑馬魚足細(xì)胞表達(dá)GADD45BA:分離斑馬魚足細(xì)胞進(jìn)行純度驗(yàn)證；B：分離斑馬魚足細(xì)胞GADD45Ba和GADD45Bb的RT-PCR結(jié)果

GADD45Ba/bb過(guò)表達(dá)加重MTZ誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷基于UAS/GAL4系統(tǒng)構(gòu)建足細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GADD45Ba和GADD45Bb轉(zhuǎn)基因斑馬魚，原位雜交結(jié)果驗(yàn)證，GADD45Ba/bb特異在轉(zhuǎn)基因斑馬魚腎小球高表達(dá)(圖4A)。Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-mcherry)與Tg(UAS:GADD45Ba/bb,cmlc:gfp)斑馬魚交配產(chǎn)卵，通過(guò)熒光篩選，帶有雙色熒光的幼魚同時(shí)表達(dá)GADD45Ba/bb和NTR基因，只有腎小球帶紅色熒光的幼魚只表達(dá) NTR基因(圖4B)。MTZ處理48h，結(jié)果顯示足細(xì)胞上表達(dá)GADD45Ba/bb斑馬魚水腫程度和水腫率明顯增高(圖4C)。Tg(pod:NTRmCherry;l-fabp:VDBP-GFP)斑馬魚表達(dá)GFP標(biāo)記維生素D (VDBP)蛋白。VDBP的分子量和等電點(diǎn)類似人Alb，可作為一個(gè)模擬反映腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性的示蹤標(biāo)記。MTZ處理后腎小球?yàn)V過(guò)屏障破壞可導(dǎo)致GFP在近端小管熒光積累(圖4D)，表明腎小球?yàn)V過(guò)屏障受損，大分子物質(zhì)濾過(guò)，以及足細(xì)胞凋亡(圖4E)和脫落。ELISA定量結(jié)果顯示，斑馬魚足細(xì)胞過(guò)表達(dá)表達(dá)GADD45Ba/bb可明顯加重MTZ誘導(dǎo)的NTR轉(zhuǎn)基因魚蛋白尿。0.1% DMSO和10 mmol/L MTZ 處理GADD45Ba/bb組并未表現(xiàn)出顯著的GFP排泄(圖4F)。Caspase-3染色結(jié)果顯示，斑馬魚足細(xì)胞表達(dá)GADD45Ba/bb可明顯加重MTZ誘導(dǎo)的NTR轉(zhuǎn)基因斑馬魚足細(xì)胞凋亡(圖4G)。

圖4 GADD45Ba/bb過(guò)表達(dá)加重MTZ誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷A：建立足細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GADD45Ba/bb斑馬魚示意圖及原位雜交；A1：對(duì)照； A2/A3：足細(xì)胞表達(dá)GADD45Ba/bb斑馬魚；B：熒光篩選轉(zhuǎn)基因斑馬魚； C：MTZ處理后水腫程度和水腫率；D：MTZ處理轉(zhuǎn)基因魚(pod:NTRmCherry; l-fabp:VDBP-GFP)后導(dǎo)致GFP在近端小管熒光積累；E：Caspase-3染色陽(yáng)性；F：ELISA檢測(cè)GFP排泄情況；G： Caspase3染色陽(yáng)性

抑制GADD45Ba/bb表達(dá)減輕MTZ誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷利用splicing MO 造成GADD45Ba/bb前體mRNA剪切異常，阻抑斑馬魚GADD45Ba/bb表達(dá)(圖5A)。對(duì)Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-mcherry)斑馬魚胚胎注射GADD45Ba/bb-MO后的RT-PCR結(jié)果顯示，除了野生型條帶，還出現(xiàn)了新條帶(圖5B)，提示MO造成了堿基的插入。MO注射3天和5天分別取30只斑馬魚行qRT-PCR檢測(cè)MO敲低程度，結(jié)果顯示，在3天和5天時(shí)GADD45Ba表達(dá)分別被抑制47.1%±6.8%、 25.3%±8.5%；GADD45Bb表達(dá)在3天和5天時(shí)被抑制42.4%±5.9%、19.2%±7.6%(圖5C、D)。MTZ處理注射過(guò)MO的Tg(pod:NTRmCherry;l-fabp:VDBP-GFP)，結(jié)果顯示，抑制GADD45Ba和GADD45Bb可顯著減輕NTR轉(zhuǎn)基因魚MTZ引起的水腫(圖5E)和蛋白尿(圖5F)。

圖5 抑制GADD45Ba/bb表達(dá)減輕MTZ誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷A：MO作用示意圖；B：RT-PCR驗(yàn)證MO剪切效果；C，D：qPCR驗(yàn)證敲低程度；E： MTZ處理后斑馬魚水腫率，NTR：未注射MO組，NTR+control MO：注射對(duì)照MO組，NTR+GADD45Ba MO：注射GADD45Ba MO組，NTR+GADD45Bb MO：注射GADD45Bb MO組；F：MTZ處理斑馬魚GFP的排泄量

討 論

GADD45B表達(dá)上調(diào)通常與應(yīng)激下生長(zhǎng)停滯或DNA損傷有關(guān)，DNA損傷可誘導(dǎo)GADD45B表達(dá)[7]。GADD45B參與了多種細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、染色質(zhì)調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期延遲。GADD45B在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮復(fù)雜作用，取決于細(xì)胞種類和刺激方式，可增強(qiáng)或抑制細(xì)胞凋亡。Gupta等發(fā)現(xiàn)在造血細(xì)胞過(guò)表達(dá)GADD45A和GADD45B，可顯著抑制DNA損傷劑，包括紫外線(UV)誘導(dǎo)的造血細(xì)胞細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活[8]。Larsen等報(bào)道，IL-1β刺激大鼠胰島素瘤細(xì)胞(INS-1E)可誘導(dǎo)GADD45B以時(shí)間依賴的方式表達(dá)增加；過(guò)表達(dá)GADD45B能顯著減少IL-1β誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞凋亡[9]。Ma等[10]發(fā)現(xiàn)在成熟的海馬神經(jīng)元中GADD45B是神經(jīng)活動(dòng)誘導(dǎo)的早期快反應(yīng)基因，GADD45B缺陷小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)活動(dòng)誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖缺陷和成年海馬新生神經(jīng)元的樹突生長(zhǎng)抑制。但也有報(bào)道稱GADD45B扮演損傷性作用。Kim發(fā)現(xiàn)，在大鼠心臟和體外心肌細(xì)胞中，GADD45B介導(dǎo)缺血/缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[11]。

據(jù)報(bào)道，GADD45B可通過(guò)與調(diào)節(jié)因子如MTK1_MEKK4相互作用參與細(xì)胞周期調(diào)控[12]。GADD45B與MTK1_MEKK4的 N-氨基末端結(jié)構(gòu)域相互作用導(dǎo)致構(gòu)象變化，釋放MTK1自動(dòng)抑制作用，MTK1激活誘導(dǎo)MKK6磷酸化，然后激活p38和c-Jun氨基末端激酶信號(hào)通路。有研究稱GADD45家族可以抑制MKK7-JNK信號(hào)通路[13]。最近，GADD45B被發(fā)現(xiàn)在環(huán)境和生理應(yīng)激下DNA去甲基化中發(fā)揮作用[14]。

斑馬魚腎單位分子組成、結(jié)構(gòu)和功能與高等哺乳動(dòng)物后腎高度保守，是近年來(lái)腎臟疾病研究理想的脊椎動(dòng)物模型，在腎病相關(guān)基因的篩查和研究中發(fā)揮了重要作用[6,15-16]。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)GADD45B在斑馬魚足細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)扮演著重要作用。同時(shí)也提供了利用斑馬魚模型研究足細(xì)胞損傷相關(guān)基因功能的模型。隨著基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9等的成熟和轉(zhuǎn)基因斑馬魚的成功構(gòu)建，斑馬魚模型在基因功能篩選中發(fā)揮了重要作用。

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