宮艷超,褚文瑋,趙偉偉
(天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與環(huán)境工程系,天津300402)
蛋白質(zhì)的翻譯后修飾與基因轉(zhuǎn)錄有著密切的關(guān)系,其中,蛋白質(zhì)的乙?;c去乙酰化修飾是由組蛋白去乙?;福℉DACs)和組蛋白乙?;福℉AT)協(xié)同調(diào)控的[1]。它們通過調(diào)節(jié)賴氨酸殘基末端的電荷狀態(tài),改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[2]。
蛋白質(zhì)的翻譯后修飾,在生物體內(nèi)具有重要的生理功能。目前,體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多種翻譯后修飾[3]。除了組蛋白的N-乙?;揎棧^1700個人源蛋白被發(fā)現(xiàn)是N-乙?;揎椀牡孜锏鞍譡4],蛋白的?;揎椬畛R姷木褪琴嚢彼釟埢┒说囊阴;揎?,除了常見的蛋白質(zhì)賴氨酸的乙酰化修飾,最近還發(fā)現(xiàn)了丙?;揎棥⒍□;揎?、丙二酰修飾以及巴豆?;揎椀萚5],但是這些修飾的生理功能以及如何影響基因的調(diào)控過程并不清楚[6]。
HDAC家族的蛋白結(jié)構(gòu)分析可以得出,其酶活中心由兩個loop組成,組成水解醋酸根的逃逸通道,loop1(藍(lán)色),具有高度保守的GG序列,loop2(粉紅色),具有核心保守序列HH,家族1和家族3,在該酶活中心是GGX-,其中,X是較大的殘基,酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe),家族2在該酶活中心的序列為PPX-,X位置為較小的甘氨酸(Gly)。以野生型組蛋白去乙?;福℉DAC8)為例,GGXHH motif X的位置是色氨酸(Trp),141位的色氨酸位于醋酸根逃逸通道的和酶活中心位置,距離乙?;挥? ?左右。
因此,本實驗以141位色氨酸為突變位點,分別突變?yōu)楸彼幔ˋla)、Gly、組氨酸(His)和 Phe,發(fā)現(xiàn)其對?;孜铮ˋ0=Ac-Arg-His-Lys-Lys(Z)-AMC,Z為乙酰)的水解能力較野生型變?nèi)?,得出HDAC8的141氨基酸所占空間位置的大小,影響其酶活性。
實驗室保存的pET-22b-hHDAC8為實驗中所用HDAC8質(zhì)粒,用于質(zhì)粒擴增的菌株E.coli trans 5α(DH 5α)感受態(tài)細(xì)胞和用于表達(dá)蛋白的菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購買于全式金生物技術(shù)有限公司,所用細(xì)胞株Hela細(xì)胞由實驗室凍存。
Millipore型純水儀(蘇州賽恩斯儀器有限公司)、BS124S天平(德國 Sartorius)、YC-2層析實驗冷柜(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)、AKTA蛋白純化儀(通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司)、Hitrap Q離子交換柱(通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司)、Superdex 200分子篩柱(通用醫(yī)療生命科學(xué)上海有限公司)、還原型谷胱甘肽(上海生工生物工程有限公司)、氯化鈉(上海生工生物工程有限公司)、胰蛋白胨(上海生工生物工程有限公司)、酵母粉(上海生工生物工程有限公司)。
1.3.1 pET-22b-hHDAC8質(zhì)粒的定點突變
將pET-22b-hHDAC8的141位Trp定點突變?yōu)闉?Gly,Ala,Phe,His,并設(shè)計其引物,進行突變。
1.3.2 pET-22b-hHDAC8的表達(dá)純化
pET-22b-hHDAC8及其突變體的表達(dá),目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL-21中,取1 μL測序正確的目的質(zhì)粒加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞BL-21中,冰浴30 min,42℃熱激90 s,冰浴5 min,加入850 μL LB培養(yǎng)基,37℃ 220 rpm振蕩 90 min,4000 rpm離心6 min,棄去部分上清,重懸涂于含氨芐100 mg/L LB固體培養(yǎng)基上,37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆加入含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩,過夜培養(yǎng)12 h左右。次日將過夜培養(yǎng)菌液加入1 LLB液體培養(yǎng)基(含氨芐100 mg/L)中,于37℃振蕩培養(yǎng),4~6 h后加入0.4 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá),繼續(xù)16℃培養(yǎng)18 h后收取菌體。
離子交換層析(Hitrap Q柱),按系統(tǒng)操作執(zhí)行進行洗泵,結(jié)束后將泵頭A、B分別放入到抽濾過的His-HDAC8離子交換低鹽緩沖液和His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液中,設(shè)置流速,接離子柱,高低鹽各處理離子柱三次,最后用5%的His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液平衡離子柱,上樣,待樣品進入系統(tǒng)內(nèi)后,將模式由Inject改為Load,將鹽濃度改為15%的His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液,用15%~35%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的His-HDAC8離子交換高鹽緩沖液進行梯度洗脫,1 mL/tube進行適當(dāng)收集,SDS-PAGE跑膠鑒定。
凝膠過濾層析(Superdex 200),按系統(tǒng)操作執(zhí)行進行洗泵,結(jié)束后將泵頭A、B放入到抽濾過的His-HDAC8分子篩緩沖液中,設(shè)置流速,接柱,用His-HDAC8分子篩緩沖液平衡Superdex 200,上樣,切換模式,并開始收集0.5 mL/tube,SDSPAGE跑膠鑒定。
1.3.3 人源HDAC8蛋白及突變體與?;孜锏拿富顪y試
純化的蛋白用紫外分光光度計測定濃度使其濃度2 mg/mL,在黑色96孔熒光板中分別加入40μL濃度為 150μM的 AMC熒光多肽底物,10 μL四種不同突變型的HDAC8酶液和50μL Assay buffer,于37℃恒溫振蕩反應(yīng)30 min,注意避光,加入 100μL含10 mg/mL胰酶和200μM SAHA的Trypsin solution終止上述反應(yīng),并在37℃恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)30 min后,在酶標(biāo)儀中于390 nm/460 nm熒光波長下測定熒光強度,分析數(shù)據(jù)。
以pET-22b-hHDAC8為模板,將HDAC8突變成 pET-22b-hHDAC8-W141G、pET-22b-hHDAC8-W141A、pET-22b-hHDAC8-W141F、pET-22b-hHDAC8-W141H,突變后測序結(jié)果如下,由測序結(jié)果可以看出,本實驗需要的位點都實現(xiàn)了定點突變,可以將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)型的菌株,實現(xiàn)后續(xù)的表達(dá)純化。
2.2.1 pET-22b-hHDAC8的表達(dá)純化
本實驗將人源的HDAC8蛋白,經(jīng)超聲破碎前,取平衡緩沖液內(nèi)全菌的樣,確定目的蛋白是否在大腸桿菌內(nèi)表達(dá),超聲破碎后,取高速離心后的上清和沉淀的樣,上清液掛住,分別取穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料,洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白,只有少量目的蛋白殘留于柱料上,HDAC8蛋白的親和層析各步驟的結(jié)果如圖1。
由圖1所見,由于HDAC8蛋白的相對分子質(zhì)量量約43,所以由親和層析圖可以看出:HDAC8蛋白出現(xiàn)在洗脫樣品中,可以進行下一步實驗。
圖1 pET-22b-hHDAC8鎳柱親和純化SDS-PAGE結(jié)果
用10mL KD的濃縮管將HDAC8蛋白的洗脫液濃縮到小體積,由于洗脫buffer含有200 mM的咪唑,300 mM KCl,所以離子交換層析之前,利用buffer,將咪唑換到1 mM以下,300 mM KCl換到50 mM KCl,如圖2。
圖2 pET-22b-hHDAC8 HitrapQ離子交換純化峰圖
我們將洗脫液經(jīng)過換buffer之后濃縮到1.5 mL,采用陰離子交換柱Hitrap Q進行純化,平衡離子柱的濃度為50 mM KCl,蛋白洗脫之前將鹽濃度拉至150 mM KCl,洗脫目的蛋白的梯度是150 mM KCl到300 mM KCl,初期的上樣過程蛋白有穿透峰,當(dāng)電導(dǎo)為24 mS/cm左右時,即開始出現(xiàn)目的蛋白峰,SDS-PAGE結(jié)果顯示11管-18管均為目的蛋白,取11-18管進行下一步純化,如圖3。
取第11-18管用10 mL KD濃縮管進行濃縮,濃縮到500 μL左右的時候,使用Superdex 200進行純化,平衡Superdex 200,保持離子濃度在150 mM KCl,上樣,洗脫,從10 mL左右出現(xiàn)了雜峰,14 mL左右開始出現(xiàn)目的蛋白峰,峰形單一對稱,按照峰寬收集蛋白跑膠,SDS-PAGE結(jié)果顯示19~24 管均為目的蛋白 HDAC8(43 KD),取第 19~24管進行濃縮,-80℃?zhèn)溆?,如圖4。
圖3 pET-22b-hHDAC8 Hitrap Q陰離子交換SDSPAGE結(jié)果
圖4 pET-22b-hHDAC8 Superdex 200分子篩SDS-PAGE結(jié)果
2.2.2 pET-22b-hHDAC8-W141G的表達(dá)純化
本實驗純化四種突變體蛋白,以甘氨酸突變體為例,將HDAC8-W141G蛋白,經(jīng)超聲破碎前后,分別取全菌、上清、沉淀、穿透、洗雜、洗雜后的柱料、洗脫、洗脫后的柱料的樣,洗脫步驟可以完全洗脫下目的蛋白,幾乎無目的蛋白殘留于柱料上,HDAC8-W141G蛋白的親和層析各步驟的結(jié)果如圖5。
圖5 pET-22b-hHDAC8-W141G鎳柱親和純化SDS-PAGE結(jié)果
由圖5可見:由于HDAC8蛋白的相對分子質(zhì)量約43左右,所以由親和層析圖可以看出,HDAC8蛋白出現(xiàn)在洗脫樣品中,可以進行下一步的實驗。
我們將洗脫液經(jīng)過換buffer之后濃縮到1.5 mL,采用陰離子交換柱Hitrap Q進行純化,平衡離子柱的濃度為50 mM KCl,蛋白洗脫之前將鹽濃度拉至150 mM KCl,洗脫目的蛋白的梯度是150 mM KCl到300 mM KCl,初期的上樣過程蛋白有穿透峰,當(dāng)電導(dǎo)為24 mS/cm左右時,即開始出現(xiàn)目的蛋白峰。SDS-PAGE結(jié)果顯示13管-23管均為目的蛋白,取13-23管進行下一步純化,如圖6。
圖6 pET-22b-hHDAC8-W141G Hitrap Q陰離子交換SDS-PAGE結(jié)果
取第 13~23管用10 mL KD濃縮管進行濃縮,濃縮到500 μL左右的時候,使用Superdex 200進行進一步的純化,平衡Superdex 200,保持離子濃度在150 mM KCl,上樣,洗脫,從 10 mL到 13 mL出現(xiàn)了雜峰,13 mL左右開始出現(xiàn)目的蛋白峰,峰形單一對稱,按照峰寬收集蛋白跑膠,SDSPAGE結(jié)果顯示20~24管均為目的蛋白HDAC8(43),取第 20~24管進行濃縮,-80℃?zhèn)溆?,如圖7。
圖7 pET-22b-hHDAC8-W141G Superdex 200分子篩SDS-PAGE結(jié)果
本實驗的實驗思路是通過酶學(xué)測試,觀察野生型HDAC8蛋白及四種突變體對熒光底物的水解能力差異,驗證HDAC8的141位與?;慕Y(jié)合關(guān)鍵點,純化的HDAC8蛋白及其突變體用紫外分光光度計測定蛋白濃度,使蛋白終濃度為0.2 mg/mL,AMC熒光多肽底物的濃度為150 μM,其它反應(yīng)時間和終止時間都一致,結(jié)果數(shù)據(jù)顯示如圖8。
圖8 HDAC8蛋白野生型及其突變體對AMC酰化底物的水解
由圖8可見:A0為乙?;疉MC四肽底物,野生型的HDAC8對其水解能力最強,四種突變體對該AMC?;孜锼饽芰Χ甲?nèi)趿?,說明141位色氨酸的突變影響了HDAC8的酶活力。
在HDAC8蛋白野生型的基礎(chǔ)上,將其酶活中心逃逸通道位置的141位的色氨酸分別突變?yōu)锳la、Gly、His和 Phe,突變成較小和較大的氨基酸,并純化表達(dá)出相應(yīng)的野生型和突變體蛋白,然后與AMC熒光底物A0測定酶活性,發(fā)現(xiàn)其對?;孜锏乃饽芰^野生型變?nèi)酰虼?,得出HDAC8的141氨基酸所占空間位置的大小,影響其酶活性的結(jié)論。
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