龍 門(mén)，周 卉，謝 文，廖 琪，王 冉*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所，江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽省熱敏性物料加工工程技術(shù)中心，安徽 滁州 239000）

噬菌體廣泛存在于自然界中，烈性噬菌體可感染或裂解細(xì)菌，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在對(duì)人類(lèi)疾病的治療方面[1-2]。近年來(lái)，通過(guò)噬菌體殺菌已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，其中彎曲桿菌[3]、大腸桿菌[4-5]、假單胞菌[6]、熱死環(huán)絲菌[7]、沙門(mén)菌[8]和李斯特菌[9]等均有大量的研究。從食品安全的角度來(lái)說(shuō)，噬菌體是預(yù)防和控制一些有害細(xì)菌，而不干擾自然生物群落細(xì)菌的最佳方式[10-11]，噬菌體不僅可以提高食品的安全性，而且也不會(huì)改變食物的色、香、味[12]，在溫度低至1 ℃時(shí)仍然能夠裂解宿主細(xì)胞，可抑制冷藏食品中細(xì)菌（特別是嗜冷菌）的生長(zhǎng)，并且一旦食品取出置于室溫條件下，噬菌體便可進(jìn)一步控制其增殖。雖然噬菌體具有巨大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，并且已經(jīng)取得了廣泛的應(yīng)用，但是由于其保存時(shí)間相對(duì)較短的特點(diǎn)也限制了在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。研究表明，浮游狀態(tài)的噬菌體穩(wěn)定性極差，在室溫條件下貯藏6～12 h后即失活，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用范圍[13-14]。

微囊化技術(shù)是一種常用的活性物質(zhì)包埋技術(shù)，該技術(shù)不但可以通過(guò)包埋法固定活性物質(zhì)以提高其穩(wěn)定性，還可以通過(guò)包埋技術(shù)調(diào)控活性物質(zhì)的釋放速率，以增加活性物質(zhì)的應(yīng)用可能性[15-16]。O’Brien等[17]通過(guò)功能性油脂微囊粉的加工，極大地促進(jìn)了其應(yīng)用可行性及穩(wěn)定性；Burgain等[18]通過(guò)微膠囊成功開(kāi)發(fā)了益生菌的包埋技術(shù)，并且應(yīng)用至工業(yè)化生產(chǎn)中。盡管活性物質(zhì)微囊化技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在醫(yī)藥、食品包裝、生物技術(shù)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但是該技術(shù)并不能實(shí)現(xiàn)對(duì)活性物質(zhì)的全部包埋，即在微囊化過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致部分活性物質(zhì)的損失[19-20]。因此，針對(duì)不同活性成分制定合適的微囊化工藝是該技術(shù)使用的前提。

JS25噬菌體分離于牛奶廠污水中，屬于肌尾噬菌體科噬菌體，具有極強(qiáng)的細(xì)菌裂解能力，可以較好地感染并殺死宿主細(xì)胞[21]；并且該類(lèi)噬菌體可以應(yīng)用到食品的重要優(yōu)勢(shì)是其沒(méi)有遺傳功能并不能轉(zhuǎn)錄細(xì)菌DNA，并且可以通過(guò)高效價(jià)感染殺死宿主細(xì)胞[22]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于噬菌體微囊化工藝的研究相對(duì)較少，并且針對(duì)海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體及其結(jié)構(gòu)表征的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體，并對(duì)制備的JS25噬菌體微囊粉進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，通過(guò)構(gòu)建4 種不同的食品模擬體系，建立微囊化JS25噬菌體在不同食品模擬體系中的釋放模型，以期為噬菌體在食品非熱殺菌的應(yīng)用中提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

vB_SauM_JS25噬菌體（以下簡(jiǎn)稱(chēng)JS25噬菌體）由江蘇省農(nóng)科院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所提供，分離自奶牛場(chǎng)污水；金黃色葡萄球菌ATCC6538 北京陸橋技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、Baird-Parker培養(yǎng)基 青島新希望生物科技有限公司；MgSO4、CaCl2、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、海藻酸鈉、鹽酸（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；TXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA2204B電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；R-134A型恒溫振蕩搖床 美國(guó)熱電公司；JL-1166型激光粒度分布測(cè)試儀 成都精新粉體測(cè)試設(shè)備有限公司；JSM-6510掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

SM緩沖液：稱(chēng)取硫酸鎂2 g、氯化鈉5.8 g、溶解于900 mL去離子水中，再加入50 mL 1 mol/L的Tris-HCl溶液，去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

微球破解液：稱(chēng)取檸檬酸鈉14.7 g，碳酸氫鈉16.8 g，溶于1 L的SM緩沖液中，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體的制備[23-24]

將4 ℃保存的金黃色葡萄球菌噬菌體JS25采用液體增殖法擴(kuò)增培養(yǎng)。將所需的海藻酸鈉溶解于100 mL、50 mmol/L Tris-HCl溶液中（pH 7.5），然后加入噬菌體懸液，攪拌混勻，噬菌體終濃度約為107PFU/mL，真空脫氣除去溶液中氣泡。將上述溶液用2 mL無(wú)菌注射器逐滴滴入所需的CaCl2溶液中形成海藻酸鈣凝膠，（20±2）℃靜置硬化30 min。過(guò)濾收集微球，用去離子水洗滌后，于4 ℃生理鹽水中保存待用。將收集到的微球于4 ℃干燥，密封保存。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

固定CaCl2添加量2.0 g/100 mL，分別以2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 g/100 mL的海藻酸鈉及按照1.3.2節(jié)中的微囊化工藝制備JS25噬菌體微囊粉，分析海藻酸鈉添加量對(duì)JS25噬菌體包埋率的影響。

固定海藻酸鈉添加量為4.0 g/100 mL，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/100 mL的CaCl2溶液按照1.3.2節(jié)中的微囊化工藝制備JS25噬菌體微囊粉，分析CaCl2添加量對(duì)JS25噬菌體包埋率的影響。

1.3.4 JS25噬菌體微囊粉制備工藝優(yōu)化

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以海藻酸鈉添加量（X1）為2.5～4.5 g/100 mL、CaCl2添加量（X2）為1.5～3.5 g/100 mL，通過(guò)Design-Expert中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels of independent variables used for central composite design

1.3.5 JS25噬菌體微囊粉穩(wěn)定性的測(cè)定

以浮游態(tài)JS25噬菌體為對(duì)照，分別分析在微囊化前后JS25噬菌體在4 ℃及20 ℃貯藏過(guò)程中的效價(jià)變化。

1.3.6 JS25噬菌體微囊粉的表征

針對(duì)上述實(shí)驗(yàn)制備的JS25噬菌體微囊粉，分別通過(guò)測(cè)定其粒徑分布及掃描電子顯微鏡結(jié)果進(jìn)行表征。

1.3.7 JS25噬菌體微囊粉釋放性能的測(cè)定

分別分析在不同食品模擬體系中的釋放性能，具體食品模擬體系如下[25]：高水分活度食品模擬體系（T1）：取105 mL 95%乙醇溶液加去離子水至1 000 mL配成10%乙醇溶液；高醇溶液食品模擬體系（T2）：取526 mL 95%乙醇溶液，添加去離子水定容至1 000 mL；水分活度為0.6～0.7的食品模擬體系（T3）：取600 mL丙三醇加去離子水至1 000 mL配成60%甘油溶液；脂肪類(lèi)食品模擬體系（T4）：1 000 mL正己烷。

1.3.8 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.8.1 JS25噬菌體包埋率[26]測(cè)定

取5 g濕微球加入45 mL微球破解液中，室溫下溶解3 h后，檢測(cè)破解液中噬菌體效價(jià)，按照下式計(jì)算包埋率。對(duì)于干燥后的微球，需先在SM緩沖液中37 ℃水化15 min后再破解。

1.3.8.2 粒徑測(cè)定[27]

采用馬爾文納米粒度基于動(dòng)態(tài)光散射原理測(cè)定儀測(cè)定JS25噬菌體微囊粉的平均粒徑。

1.3.8.3 掃描電子顯微鏡觀察[28]

取適量JS25噬菌體微囊粉，將其用膠黏附于鋁制的樣品載物臺(tái)上，再放入真空噴涂?jī)x內(nèi)進(jìn)行蒸鍍Au/Pd，最終于JSM-6510掃描電子顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.3.8.4 釋放率測(cè)定[29]

JS25噬菌體微囊粉釋放率為不同模擬液中JS25噬菌體效價(jià)與微球裂解液中JS25噬菌體效價(jià)的比值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用SAS 9.2進(jìn)行ANOVA分析，不同平均值之間利用LSD（least-significant difference）法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（ ±s，n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理?xiàng)l件對(duì)JS25噬菌體微囊粉包埋率的影響

圖1 不同處理?xiàng)l件對(duì)包埋率的影響Fig.1 Effects of different conditions on microencapsulation eff i ciency

從圖1可以看出，隨著二者添加量的增加，JS25噬菌體的包埋率均呈現(xiàn)顯著的（P＜0.05）先增加后降低的趨勢(shì)。對(duì)于海藻酸鈉，當(dāng)添加量在2.5～4.5 g/100 mL時(shí)，噬菌體有較高的包埋率。過(guò)高的添加量（大于5.0 g/100 mL）增加了溶液凝膠的黏稠度，造成膠體結(jié)塊，從而降低了噬菌體的包埋率；而過(guò)低的添加量（低于2.5 g/100 mL）則降低了膠體的黏稠度，從而不能完成對(duì)噬菌體的包埋。而對(duì)于CaCl2，當(dāng)添加量在1.5～3.5 g/100 mL時(shí)，噬菌體有較高的包埋率；而過(guò)低的添加量不能夠完成對(duì)膠體顆粒的硬化，過(guò)高添加量則可能會(huì)導(dǎo)致膠體微球破解，從而降低了JS25噬菌體的包埋率。

2.2 JS25噬菌體微囊粉制備工藝優(yōu)化結(jié)果

如表2所示，海藻酸鈉及CaCl2不同添加量對(duì)微囊粉的包埋率有顯著的影響（P＜0.05）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Central composite design with experimental values of microencapsulation eff i ciency

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸分析，建立包埋率對(duì)試驗(yàn)中涉及的2 個(gè)因素變量的二次多項(xiàng)式的回歸方程：Y=-151.98+100.87X1+40.62X2-3.42X1X2-12.39X12-5.46X2

由圖2可知，2 個(gè)因素對(duì)JS25噬菌體的包埋率有明顯的交互作用，并且在試驗(yàn)研究范圍內(nèi)，單一因素的臨界值（最適添加量）隨另外因素的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，與單因素試驗(yàn)結(jié)果相似。

圖2 海藻酸鈉和CaCl2添加量交互作用結(jié)果Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of sodium alginate and CaCl2 on microencapsulation eff i ciency

以JS25噬菌體包埋率最大值為目標(biāo)值，對(duì)構(gòu)建的二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化后得到，在海藻酸鈉添加量3.72 g/100 mL、CaCl2添加量2.55 g/100 mL條件下，JS25噬菌體存在最大的包埋率為87.43%，以該條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到，JS25噬菌體包埋率為（88.38±0.38）%，與理論值相對(duì)誤差小于5%。說(shuō)明該工藝準(zhǔn)確可靠，可以用于JS25噬菌體微囊粉的生產(chǎn)加工。

2.3 JS25噬菌體微囊粉結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.3.1 掃描電子顯微鏡結(jié)果

圖3 掃描電子顯微鏡結(jié)果Fig.3 Scanning electron micrographs of sodium alginate and microcapsules

為了進(jìn)一步表征JS25噬菌體的顆粒形態(tài)，通過(guò)掃描電子顯微鏡對(duì)JS25噬菌體微囊粉（圖3b）及海藻酸鈉凝膠（圖3a）進(jìn)行表征后可以看出，微囊粉呈均勻的顆粒狀分布，而海藻酸鈉膠體大致呈網(wǎng)狀、塊狀結(jié)構(gòu)。說(shuō)明該方法能有效制備JS25噬菌體微囊粉，并且微囊顆粒分布均勻。

2.3.2 JS25噬菌體微囊粉粒徑分布

圖4 JS25噬菌體粒徑分布Fig.4 Size distribution of microcapsules

由圖4可知，微囊粉粒徑范圍在20～90 μm之間，且呈正態(tài)分布。其中粒徑范圍在30～50 μm之間的微囊粉約占60%。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)得到的JS25噬菌體微囊粉顆粒均勻，該工藝能有效、均勻地完成對(duì)噬菌體的包埋。

2.4 JS25噬菌體微囊粉的穩(wěn)定性結(jié)果

圖5 JS25噬菌體微囊粉穩(wěn)定性結(jié)果Fig.5 Stability of microcapsules

從圖5可以看出，在4 ℃時(shí)，浮游態(tài)噬菌體在貯藏1 d時(shí)，效價(jià)從7.8（lg（PFU/g））迅速降至0（lg（PFU/g）），而JS25噬菌體微囊粉在貯藏35 d后，效價(jià)發(fā)生輕微降低，但是無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在20 ℃時(shí)，浮游態(tài)噬菌體在6 h后即失活，而噬菌體微囊粉在1 d后呈略微的降低，在貯藏35 d后，效價(jià)從6.81（lg（PFU/g））降低至5.41（lg（PFU/g）），僅下降1.4（lg（PFU/g））。說(shuō)明微囊粉能有效地完成對(duì)JS25噬菌體的包埋，并且可維持噬菌體活性至35 d。

2.5 食品模擬體系中JS25噬菌體微囊粉釋放結(jié)果

釋放性能是載藥微囊粉的重要性能指標(biāo)，既可以保持活性物質(zhì)在體系中不斷釋放，也可以提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，從而達(dá)到長(zhǎng)效作用[30]。從圖6可以看出，在不同種類(lèi)的食品模擬體系中，JS25噬菌體釋放規(guī)律相同，在0～5 min均能夠快速地釋放，在釋放5～8 min后變緩并逐漸穩(wěn)定。具體表現(xiàn)為：JS25噬菌體在T1體系中有最快的釋放速度，在體系中2 min后釋放率可達(dá)79.35%，隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，釋放率逐漸增加，在6 min后達(dá)到98%，隨后無(wú)顯著差異（P＞0.05）。另外，JS25噬菌體在T4體系中的釋放率在5 min后趨于穩(wěn)定，可達(dá)到91%；在T3體系中在6 min時(shí)趨于穩(wěn)定，釋放率可達(dá)到84%；在T2體系中釋放率最低，在7 min后逐漸穩(wěn)定，釋放率可達(dá)75%。

對(duì)圖6不同食品模擬體系中JS25噬菌體的釋放曲線進(jìn)行數(shù)學(xué)釋放模型擬合，擬合所得方程對(duì)應(yīng)的決定系數(shù)R2見(jiàn)表3。從表3可以看出，在T1、T2、T4體系中，噬菌體的釋放行為符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型y=a×（1-exp（-bx）），且R2均大于0.9；而在T3體系中，噬菌體的釋放行為符合Higuchi模型。綜合上述結(jié)果可以看出，JS25噬菌體微囊粉在不同食品模擬體系中均有理想的釋放效果，并且釋放率均高于75%。

圖6 食品模擬體系中JS25噬菌體釋放曲線Fig.6 Release curve of microencapsulated phage in food simulant systems

表3 JS25噬菌體釋放動(dòng)力學(xué)模型擬合Table3 Kinetic model equations and determination coeff i cients for release of microencapsulated phage

3 結(jié)論與討論

海藻酸鈉和CaCl2組成的體系能有效地構(gòu)建JS25噬菌體微囊粉，表現(xiàn)為隨著二者添加量的增加，JS25噬菌體的包埋率呈顯著的（P＜0.05）先增加后降低的趨勢(shì)，并且二者對(duì)包埋率有顯著的交互作用；通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到海藻酸鈉和CaCl2添加量分別為3.72、2.55 g/100 mL時(shí)，JS25噬菌體包埋率可達(dá)到最大值88.38%。實(shí)驗(yàn)得到的JS25噬菌體微囊粉有穩(wěn)定的顆粒結(jié)構(gòu)，且顆粒粒徑在20～90 μm之間呈正態(tài)分布。另外，該狀態(tài)的噬菌體穩(wěn)定性顯著增加，表現(xiàn)為與浮游態(tài)噬菌體失活相比，在4 ℃及20 ℃條件下噬菌體微囊粉貯藏35 d也有較高的效價(jià)。JS25噬菌體微囊粉在不同的食品模擬體系中均迅速釋放并逐漸穩(wěn)定，在不同體系中釋放8 min后，釋放率可達(dá)到75%以上；并且其釋放規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型及Higuchi模型。說(shuō)明該工藝可以用于對(duì)JS25噬菌體的微囊化包埋，以提高JS25噬菌體的穩(wěn)定性。

JS25噬菌體作為一種天然的殺菌劑，廣泛應(yīng)用于食品保鮮中，可增強(qiáng)食品的安全性和延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，但是天然噬菌體大多為浮游態(tài)，極易失活，從而限制了其在食品保鮮加工中的應(yīng)用。目前，采用海藻酸鹽固定天然活性成分已經(jīng)取得了廣泛應(yīng)用，Diamante等[31]通過(guò)海藻酸鹽成功包埋了乳酸鏈球菌，并顯著提高了其穩(wěn)定性；Prisco等[32]通過(guò)微囊化技術(shù)固定了Lactobacillus reuteri DSM 17938益生菌，增強(qiáng)了其在食物和腸道中的穩(wěn)定性。但是，在不同的研究成果中得到的微囊粉形態(tài)卻存在較大的差異，從掃描電子顯微鏡結(jié)果可以看出，通過(guò)海藻酸鈉-CaCl2體系可以將噬菌體包埋為微米級(jí)別的微囊粉，微囊粉呈不規(guī)則的圓球狀，可能是因?yàn)楹Ｔ逅徕c在擠出階段或在CaCl2溶液中硬化過(guò)程中導(dǎo)致，但是也有研究報(bào)道可能是由于噬菌體表面和海藻酸鈉之間的相互作用導(dǎo)致[10]。另外，在20 ℃條件下，與浮游態(tài)噬菌體在6 h即失活相比，微囊粉態(tài)噬菌體在貯藏35 d僅失活15.66%，說(shuō)明微囊粉能有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)JS25噬菌體的包埋，并且可維持噬菌體活性至35 d以上。JS25噬菌體微囊粉在不同液態(tài)食品模擬液中的釋放率存在差異，可能是由于液態(tài)食品中的水分活度及黏度不同導(dǎo)致。

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