郭志華，段騰飛，江翠翠，王 芳

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

植物內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段，生活于健康植物各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，不引起植物組織明顯癥狀改變的微生物[1-3]。2008年，碭山酥梨產(chǎn)區(qū)暴發(fā)梨炭疽病，病果率達(dá)到70%以上，僅安徽省碭山縣梨農(nóng)直接經(jīng)濟(jì)損失超過7億 元[4]。炭疽菌主要侵害果實(shí)和葉片，導(dǎo)致果實(shí)整體腐爛，果皮變黑色[5]。現(xiàn)在對炭疽菌的有效防治主要是化學(xué)農(nóng)藥[6]，長期使用化學(xué)農(nóng)藥易使病菌產(chǎn)生耐藥性，并且化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境，可通過環(huán)境食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人體健康[7]。內(nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)，生存環(huán)境穩(wěn)定，可經(jīng)受住植物自身的防衛(wèi)反應(yīng)，與病菌直接相互作用[8]。

國內(nèi)外科研人員已經(jīng)分離篩選一些重要的生防微生物。柳鳳等[9]從紅樹林體內(nèi)分離的內(nèi)生菌AiL3，對芒果炭疽菌抑菌效果較好。李春玲等[10]從芒果表皮分離得到29株內(nèi)生細(xì)菌，對峙培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)菌株B2-1對芒果炭疽菌菌絲的生長具有較強(qiáng)抑制作用。石晶盈等[11]從番木瓜果皮內(nèi)篩選具有較強(qiáng)拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌防治番木瓜采后炭疽病和疫霉病，以減少果實(shí)采后病害帶來的損失。袁紅旭等[12]從不同品種柑橘果實(shí)中分離出16 株內(nèi)生細(xì)菌，研究篩選出4 株對柑橘炭疽病有較好防治作用、具有應(yīng)用前景的拮抗內(nèi)生細(xì)菌。具有較好拮抗植物病原微生物的內(nèi)生細(xì)菌種類中芽孢桿菌較多，芽孢桿菌能產(chǎn)生強(qiáng)效抑菌物質(zhì)，具有培養(yǎng)要求簡單、繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)[13]。美國迄今已有3 株枯草芽孢桿菌和1 株解淀粉芽孢桿菌獲得商品化生產(chǎn)許可[14]。關(guān)于芽孢桿菌生防機(jī)制主要包括營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競爭、分泌抗菌物質(zhì)、溶菌作用，誘導(dǎo)植物抗病性等方面[15-16]，其中分泌抗菌物質(zhì)研究的較多，芽孢桿菌分泌的抗菌物質(zhì)包括抗菌蛋白和抗菌脂肽類物質(zhì)[17-18]。

本研究以安徽特產(chǎn)碭山梨為研究對象，從健康碭山梨中分離篩選拮抗碭山梨炭疽菌的內(nèi)生菌，通過形態(tài)特征觀察、理化性質(zhì)測試和16S rDNA鑒定菌株。檢測發(fā)酵液抑菌性，研究發(fā)酵蛋白粗提液性質(zhì)和內(nèi)生菌對感染炭疽菌的碭山梨果實(shí)防御酶活性的影響，初步研究碭山梨內(nèi)生菌拮抗炭疽菌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碭山梨采自宿州碭山良梨鎮(zhèn)果園；碭山梨膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）為實(shí)驗(yàn)室保存。

PDA培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 000 mL、自然pH值。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌）：牛肉膏5.0 g 、蛋白胨10.0 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4。

DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、膠回收試劑盒、蛋白酶K美國Sigma公司；其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204分析天平 上海天平儀器技術(shù)公司；BBS-SDC-A超凈工作臺 博科生物公司；MyCycler PCR擴(kuò)增儀 美國Bio-Rad公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱上海精宏公司。

1.3 方法

1.3.1 碭山梨內(nèi)生菌的分離

從碭山果園采收無病蟲害、成熟度較好的碭山梨。取約0.5 g果肉放到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h；取200 μL培養(yǎng)液涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h；用無菌牙簽蘸取單菌落轉(zhuǎn)接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，平板劃線純化后保存。

1.3.2 內(nèi)生菌對碭山梨膠孢炭疽菌菌絲生長的抑制作用

將碭山梨膠孢炭疽菌在PDA平板上活化待用；將內(nèi)生菌分別置于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，使菌液濃度為104～105CFU/mL待用。

平板對峙培養(yǎng)法：用打孔器（d=6 mm）在活化好的碭山梨膠孢炭疽菌的菌落邊緣打取菌絲塊，將菌絲塊挑入PDA平板中心，培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)皿的上下左右距離菌絲塊2 cm處各放置1 片無菌濾紙圓片，在每個(gè)濾紙片上注入20 μL的內(nèi)生菌菌液。接種后的培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次，以濾紙片上注入無菌水作為對照。5 d后對平板抑制情況進(jìn)行拍照處理并按下式計(jì)算菌絲生長抑制率[18-19]。

1.3.3 內(nèi)生菌DSL-9的鑒定

觀察DSL-9單菌落形狀、顏色、表面等培養(yǎng)特征；革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形狀、排列方式等形態(tài)特征。DSL-9菌株進(jìn)行甲基紅、接觸酶、明膠液化、淀粉水解、產(chǎn)吲哚、硝酸鹽還原、糖發(fā)酵等實(shí)驗(yàn)[20-21]。以細(xì)菌16S rDNA通用引物為上下游引物，染色體DNA為模板擴(kuò)增DSL-9菌株的16S rDNA[22]。PCR產(chǎn)物由上海生物工程有限公司測序，所得16S rDNA序列通過NCBI網(wǎng)站BLAST進(jìn)行核酸數(shù)據(jù)比對。

1.3.4 DSL-9發(fā)酵液對碭山梨膠孢炭疽菌拮抗作用

內(nèi)生菌DSL-9培養(yǎng)至菌液濃度為105～106CFU/mL，制備待測液分別為：發(fā)酵菌液離心后取上清液，用濾膜過濾得無菌體濾液；發(fā)酵液經(jīng)121 ℃、15 min處理；無菌水。待測液均勻涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將碭山梨膠孢炭疽菌菌絲塊置于平板中央。

1.3.5 內(nèi)生菌DSL-9蛋白粗提物制備

內(nèi)生菌DSL-9培養(yǎng)液離心后取無菌上清液，上清液用(NH4)2SO4飽和溶液鹽析，4 ℃沉淀過夜，離心30 min，棄去上清液，以pH 7.2磷酸緩沖液溶解沉淀，4 ℃透析過夜，透析液12 000 r/min離心20 min，上清液0.22 μm濾膜過濾，為蛋白粗提液，4 ℃保存?zhèn)溆肹14]。

蛋白粗提液分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴鍋中水浴1 h，90、100、110、120 ℃油浴1 h且冷凝回流，按1.3.2節(jié)方法計(jì)算抑菌率。

用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)蛋白粗提液pH值為4、5、6、7、8、9、10七個(gè)梯度，同時(shí)保證蛋白濃度不發(fā)生改變， 4 ℃過夜，按1.3.2節(jié)方法計(jì)算抑菌率。

將蛋白粗提液置于25 W紫外燈下10 cm處照射2、4、6、8、10 h，按1.3.2節(jié)方法計(jì)算抑菌率。

蛋白粗提液中加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K，終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，37 ℃水浴1 h，80 ℃水浴處理30 min使蛋白酶變性，按1.3.2節(jié)方法計(jì)算抑菌率。

1.3.7 內(nèi)生菌DSL-9對染病果實(shí)生理生化的影響

主成分分析圖可以直觀地反映出各樣品的相對位置及與感官特征的相關(guān)關(guān)系，樣品之間、樣品與感官特征之間的相對位置越近，表明它們在風(fēng)味特征上，關(guān)系越密切[27]，16種怪味胡豆樣品與風(fēng)味特征在F1/F2坐標(biāo)中的分布，見圖1。

選取健康碭山梨果實(shí)，75%乙醇溶液表面消毒，表面噴炭疽菌培養(yǎng)液，以果實(shí)表面布滿為準(zhǔn)，果面晾干后再噴內(nèi)生菌培養(yǎng)液，以果實(shí)表面布滿為準(zhǔn)，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后1、2、3、4、5、6、7 d分別測量可溶性蛋白含量和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的實(shí)驗(yàn)均做3 次平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碭山梨內(nèi)生菌的分離

從碭山梨中共分離純化15 株內(nèi)生菌，分別命名為DSL-1、DSL-2、DSL-3、DSL-4……DSL-15。其中經(jīng)革蘭氏染色6 株為革蘭氏陰性菌，9 株為革蘭氏陽性菌。

2.2 拮抗碭山梨炭疽菌的內(nèi)生菌的篩選

15 株內(nèi)生菌對碭山梨膠孢炭疽菌抑菌率分別為34%、25%、2%、3%、0%、18%、10%、30%、56%、12%、21%、16%、0%、11%、20%。其中內(nèi)生菌DSL-9的抑菌率為56%，抑菌效果最好。從圖1A可知，未轉(zhuǎn)接內(nèi)生菌DSL-9的平板中，碭山梨膠孢炭疽菌菌絲生長正常，菌落呈圓形擴(kuò)展。圖1B中接種內(nèi)生菌DSL-9，內(nèi)生菌DSL-9對炭疽菌的菌絲生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，形成十字形，這可能是因?yàn)镈SL-9分泌的代謝物對炭疽菌的菌絲生長產(chǎn)生抑制作用。

圖1 內(nèi)生菌DSL-9抑制碭山梨炭疽菌菌絲生長的菌落圖Fig.1 DSL-9 inhibited the mycelial growth of C. gloeosporioides

2.3 內(nèi)生菌DSL-9的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征觀察

DSL-9革蘭氏染色為陽性，顯微鏡觀察DSL-9菌體為桿狀，菌體中央有橢圓狀芽孢，平板觀察菌落微黃色，表面干燥粗糙。

2.3.2 生理生化特征鑒定

DSL-9菌株甲基紅實(shí)驗(yàn)陽性、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)陽性、葡萄糖培養(yǎng)產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、不發(fā)酵乳糖、可液化明膠、水解淀粉、不產(chǎn)吲哚。

2.3.3 16S rDNA 的擴(kuò)增和序列分析

以DSL-9菌株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增得大小約為1.5 kb的基因片段。采用BLAST與GenBank中已登錄的基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSL-9的16S rDNA與枯草芽孢桿菌同源性為98%。根據(jù)形態(tài)特征觀察、生理生化特征鑒定和16S rDNA的序列分析，DSL-9初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[20-21]。

2.4 DSL-9發(fā)酵液對碭山梨膠孢炭疽菌拮抗作用

圖2 不同處理DSL-9培養(yǎng)液對碭山梨膠孢炭疽菌拮抗作用Fig.2 Effect of different treatments on inhibitory activity of the culture broth of DSL-9 against C. gloeosporioides

如圖2所示，發(fā)酵液經(jīng)3 種方式處理后，內(nèi)生菌DSL-9發(fā)酵液和離心后上清液經(jīng)過濾后的無菌體發(fā)酵液幾乎抑制炭疽菌的生長，說明內(nèi)生菌DSL-9對炭疽菌生長有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌物質(zhì)可能是DSL-9菌株分泌到胞外的代謝產(chǎn)物；圖2C和圖2D可觀察到完整的炭疽菌菌落，菌絲生長正常，說明經(jīng)121 ℃、20 min處理后的發(fā)酵液和無菌水均無抑菌活性，121 ℃高溫可使發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)失活。

2.5 內(nèi)生菌DSL-9蛋白粗提液性質(zhì)分析

2.5.1 溫度對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響

圖3 溫度對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of temperature on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

內(nèi)生菌DSL-9蛋白粗提液具有較好的熱穩(wěn)定性，如圖3所示，30～60 ℃水浴1 h抑菌率變化不大。隨著處理溫度逐漸升高，抑菌率逐漸下降。100 ℃熱處理1 h，抑菌率是30 ℃的60%左右，在120 ℃熱處理1 h，抑菌活性幾乎喪失。

2.5.2 pH值對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響

圖4 pH值對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of pH on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

從圖4可看出，蛋白粗提液在pH值在4～5區(qū)間抑菌率較低，在pH值為4時(shí)只有pH值為7時(shí)抑菌活性的58%。pH值為7時(shí)抑菌活性最高，pH值在7～10區(qū)間抑菌活性無明顯變化，抑菌物質(zhì)在堿性環(huán)境有活性。

2.5.3 紫外線對DSL-9蛋白粗提液活性的影響

DSL-9蛋白粗提液經(jīng)25 W紫外燈照射后，抑菌率如圖5所示，基本無變化，表明DSL-9抗菌物質(zhì)對紫外線不敏感，具有一定的抗紫外線功能。

圖5 紫外線對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of UV light on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

2.5.4 蛋白酶對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響

在用不同的蛋白酶對內(nèi)生菌進(jìn)行處理后，抑菌率的變化如圖6所示，經(jīng)不同蛋白酶處理后，抑菌率下降幅度較大（P＜0.01），仍有部分抑菌率，說明DSL-9抑菌物質(zhì)可能部分是蛋白質(zhì)，部分是其他物質(zhì)。

圖6 蛋白酶對DSL-9蛋白粗提液抑菌活性的影響Fig.6 Effect of proteases on inhibitory activity of the antifungal substance from strain DSL-9

2.6 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨的防御酶的影響

2.6.1 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨PPO的影響

圖7 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨PPO的影響Fig.7 Effect of DSL-9 on PPO of Dangshan pear infected with anthrax

由圖7可看出，腐敗菌對碭山梨的侵染短時(shí)間內(nèi)PPO活性是增高的，但隨著侵染時(shí)間的延長，3 d后活性顯著降低。可能是因?yàn)樘烤揖鷮麑?shí)侵染后，PPO迅速感應(yīng)，活性顯著升高，對植物組織起到一定的保護(hù)作用，但隨著侵染時(shí)間的延長，PPO活性下降。處理組的PPO活性高峰出現(xiàn)在第4天，比病菌組推遲，且PPO最大活性低于病菌組。

2.6.2 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨SOD的影響

圖8 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨SOD的影響Fig.8 Effect of DSL-9 on SOD of Dangshan pear infected with anthrax

從圖8可看出，病菌組的SOD活性在第3天達(dá)到最大值，病菌的侵染屬于生理性脅迫，可導(dǎo)致果肉組織產(chǎn)生大量活性氧和自由基，SOD的產(chǎn)生可保護(hù)植物細(xì)胞免受損傷。處理組的SOD活性變化和對照組的趨勢一致，先上升后下降，這說明內(nèi)生菌DSL-9能減輕病菌對梨果實(shí)的侵染。

2.6.3 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨POD影響

圖9 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨POD的影響Fig.9 Effect of DSL-9 on POD of Dangshan pear infected with anthrax

由圖9可看出，病菌組和處理組POD活性變化趨勢一致，先上升后下降，在第4天達(dá)到活性高峰，但是處理組的POD活性高峰大于病菌組，說明內(nèi)生菌可能有誘導(dǎo)POD活性升高的作用。

2.6.4 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨CAT的影響

圖10 內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨CAT的影響Fig.10 Effect of DSL-9 on CAT of Dangshan pear infected with anthrax

由圖10可看出，內(nèi)生菌DSL-9對感染炭疽菌碭山梨CAT的影響的趨勢和其他防御酶相似，都是先上升后下降，CAT活性高峰出現(xiàn)在第3天，處理組CAT活性高于病菌組，說明內(nèi)生菌可誘導(dǎo)CAT活性，提高碭山梨的抗性。

3 討 論

近幾年，碭山梨感染炭疽菌，導(dǎo)致產(chǎn)量急劇下降，使用化學(xué)農(nóng)藥作為殺菌劑易污染環(huán)境，危害人體健康。內(nèi)生菌可作為生物防治菌，本實(shí)驗(yàn)從健康碭山梨中分離出15 株內(nèi)生菌，采用平板對峙培養(yǎng)法篩選出1 株對碭山梨膠孢炭疽菌抑菌活性較高的菌株，命名為DSL-9，采用形態(tài)特征和16S rDNA，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枯草芽孢桿菌能夠拮抗超過30 種的植物病原菌，是目前生物防治和水果保鮮中研究最多的一種有益微生物[23]。DSL-9發(fā)酵液經(jīng)處理后發(fā)現(xiàn)無菌體發(fā)酵液具有較好抑菌活性，說明DSL-9菌株對炭疽菌的抑制作用主要是通過胞外分泌物作用的結(jié)果，這與先前報(bào)道一致[24]。

采用硫酸銨沉淀法獲得DSL-9的粗蛋白提取液，蛋白提取液在30～60 ℃抑菌率無明顯變化，高于60 ℃抑菌率下降，說明抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好。在pH 7～10區(qū)間抑菌活性較高，且無明顯變化，說明抑菌物質(zhì)在堿性環(huán)境具有較好的抑菌活性。紫外線對抑菌物質(zhì)無明顯影響。蛋白提取液經(jīng)蛋白酶處理后，抑菌活性下降，但仍有部分抑菌活性，說明抑菌物質(zhì)含有蛋白質(zhì)，還可能含有其他物質(zhì)，現(xiàn)已報(bào)道的枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有肽類、環(huán)脂肽類、多烯類等[21]?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的脂肽類抗菌物質(zhì)對蛋白酶具有穩(wěn)定性；蛋白類抗菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性較差，易被蛋白酶分解[25-29]，DSL-9產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)既有脂肽類抗菌物質(zhì)也有蛋白抗菌物質(zhì)。

PPO、POD、SOD和CAT共同組成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，在清除超氧陰離子自由基、H2O2和過氧化物以及組織或減少羥自由基形成等方面發(fā)揮重要作用。接種病原菌后果實(shí)中的防御酶活性均顯著高于對照，且在觀察期內(nèi)出現(xiàn)活性高峰，說明果實(shí)在逆境條件下能最大限度的被激發(fā)產(chǎn)生防御酶活性，暫時(shí)減輕病害侵染造成的傷害，處理組的活性高峰低于病菌組，說明處理組的病害比病菌組要輕。侵染后期這些酶的活性均受到抑制作用，細(xì)胞內(nèi)活性氧積累過多，造成膜脂過氧化，破壞質(zhì)膜通透性，損壞細(xì)胞。病菌組在后期防御酶活性均低于對照組和處理組。

綜上可知內(nèi)生菌DSL-9可以抑制炭疽菌的生長并可能誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性，內(nèi)生菌DSL-9拮抗炭疽菌具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] 林玲, 喬勇升, 顧本康, 等. 植物內(nèi)生細(xì)菌及其生物防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 24(6)∶ 969-974. DOI∶10.3969/j.issn.1000-4440.2008.06.049.

[2] 張祺玲, 楊宇紅, 譚周進(jìn), 等. 植物內(nèi)生菌的功能研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào), 2010(7)∶ 28-34. DOI∶10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.07.016.

[3] 石晶盈, 陳維信, 劉愛媛. 植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2006, 26(7)∶ 2395-2400. DOI∶10.3321/j.issn∶1000-0933.2006.07.044.

[4] 吳良慶, 朱立武, 衡偉, 等. 碭山梨炭疽病病原鑒定及其抑菌藥劑篩選[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43(18)∶ 3750-3758. DOI∶10.3864/j.issn.0578-1752.2010.18.008 .

[5] 高正輝, 張金云, 伊興凱, 等. 碭山酥梨炭疽病發(fā)生特征與防治技術(shù)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(19)∶ 10445-10446. DOI∶10.3969/j.issn.0517-6611.2010.19.184.

[6] 于曉麗, 亓超, 王培松, 等. 果樹真菌病害拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及拮抗機(jī)制初探[J]. 果樹學(xué)報(bào), 2016, 33(6)∶ 734-743. DOI∶10.1395/j.cnki.gsxb.0150483.

[7] 史鳳玉, 朱英波, 吉志新, 等. 枯草芽孢桿菌QDH-1-1對采后蘋果青霉病的抑制效果[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2007, 7(4)∶ 80-82. DOI∶10.3969/j.issn.1009-7848.2007.04.016 .

[8] 劉起麗, 張建新, 徐瑞富, 等. 柑橘皮內(nèi)生細(xì)菌分離及柑橘青霉病菌拮抗菌篩選研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(28)∶ 235-239.

[9] 柳鳳, 何紅, 詹儒林, 等. 拮抗芒果炭疽病菌的紅樹內(nèi)生細(xì)菌篩選及AiL3菌株抗菌物質(zhì)研究[J]. 中國生物防治, 2010, 26(3)∶ 293-299.

[10] 李春玲, 王慶國, 胥麗娜, 等. 一株芒果炭疽病拮抗菌抑菌活性的研究及其鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(11)∶ 110-115.

[11] 石晶盈, 劉愛媛, 李雪萍, 等. 番木瓜果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌MGP3菌株的鑒定及拮抗作用[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(9)∶ 1240-1247.

[12] 袁紅旭, 陳勇明, 何財(cái)能, 等. 拮抗炭疽病的柑橘內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選[J]. 果樹學(xué)報(bào), 2005, 22(5)∶ 510-514. DOI∶10.3969/j.issn.1009-9980.2005.05.017.

[13] 劉錦霞, 李娜, 李晶, 等. 生防菌株SW11在番茄植株上的定殖能力及其對番茄灰霉病的防控效[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2015, 31(3)∶353-360. DOI∶10.16409/j.cnki.2095-039x.2015.03.010.

[14] 鄭雪芳, 劉波, 朱育菁, 等. 番茄青枯病生防芽胞桿菌的篩選與鑒定[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2016, 32(5)∶ 657-665. DOI∶10.16409/j.cnki.2095-039x.2016.05.016.

[15] 陳志誼. 芽孢桿菌類生物殺菌劑的研發(fā)與應(yīng)用[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2015, 31(5)∶ 723-732. DOI∶10.16409/j.cnki.2095-039x.2015.05.012.

[16] 雍道敬, 彩霞, 李桂舫, 等. 內(nèi)生放線菌A-1對蘋果果實(shí)輪紋病的防效及防御性酶活性的影響[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2014, 41(3)∶ 336-340.

[17] 黃海嬋, 裘娟萍. 枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005(3)∶ 213-215. DOI∶10.3969/j.issn.0528-9017.2005.03.022.

[18] 邢介帥, 李然, 趙蕾, 等. 生防芽孢桿菌T2胞外蛋白酶的純化及其抗真菌作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2008, 38(4)∶ 377-381. DOI∶10.3321/j.issn∶0412-0914.2008.04.007.

[19] 魏彩燕, 毛雪琴, 柴榮耀, 等. 草莓炭疽病生防菌株MT-06的鑒定及生物學(xué)特性[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2010, 29(4)∶ 481-487.

[20] HOLT G J, KRIEG N R, SNEATH P H A, et al. Bergey’ smanual of determinative bacteriology[M]. 9th ed. Baltimore: Williams &Wilkins, 1994: 260-274.

[21] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社,2001∶ 108-110.

[22] 郭志華, 楊洪. 分離自藏靈菇的乳酸菌的益生特性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(1)∶ 151-154.

[23] 黃曦, 張榮燦, 王何健, 等. 枯草芽孢桿菌ON-6菌株抑制荔枝炭疽菌活性物質(zhì)的初步研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(13)∶ 188-193.

[24] 汪遠(yuǎn), 詹儒林, 何紅, 等. 紅樹內(nèi)生細(xì)菌菌株Kc-38的抗菌物質(zhì)及對采后芒果炭疽病的防效[J]. 中國生物防治學(xué), 2011, 27(1)∶ 82- 87.

[25] OHNO A, ANO T, SHODA M. Effect of temperature change and aeration on the production of antifungal peptide antibiotic iturin by Bacillus subtilis NB22 in liquid cultivation[J]. Journal of Fermentations and Bioengineering, 1993, 75(6)∶ 463-465.DOI∶10.1016/0922-338x(93)90098-s.

[26] AKPA E, JACQUES P, WATHELET B. Influence of culture conditions on lipopeptide production by Bacillus subtilis[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2001, 93(9): 551-561. DOI:10.1385/ABAB:91-93:1-9:551.

[27] KENJI T, TAKAHASHI A, MAKOTO S. Isolation of a gene essential for biosynthesis of the lipopeptide anti bioticsplipastatin B1 and surfactinin Bacillus subtilis YB8[J]. Archives of Microbiology, 1996,165: 243-251. DOI:10.1007/s002030050322.

[28] STOVER A G, DRIKS A. Secretion, localization, and antibacterial activity of TasA, a Bacillus subtilis pore-associated protein[J]. Journal of Bacteriology, 1999, 181(5)∶ 1664-1672.

[29] 王祺, 張一名, 趙君, 等. 枯草芽孢桿菌S-16抑菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)及培養(yǎng)條件的研究[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2015, 31(3)∶ 439-444.DOI∶10.16409/j.cnki.2095-039x.2015.03.022.