劉國榮，任桂美，李 雪，王成濤*

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048）

乳酸菌細菌素是乳酸菌在生長代謝過程中通過核糖體機制合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優(yōu)點，已成為益生菌生物活性代謝產(chǎn)物研究與開發(fā)的熱點[1]。群體感應(yīng)是微生物通過合成、分泌、感知與群體密度相關(guān)的信號分子，啟動特定基因表達來適應(yīng)環(huán)境變化的現(xiàn)象。群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究有助于了解微生物對外界環(huán)境的識別、認知機制，實現(xiàn)人為干擾或促進特定成分的表達以滿足實際生產(chǎn)需要。群體感應(yīng)涉及生物發(fā)光調(diào)控、毒力因子產(chǎn)生、生物被膜形成、細菌素合成等諸多生理過程[2]。

產(chǎn)細菌素乳酸菌普遍存在不同程度的群體感應(yīng)現(xiàn)象，如棲魚肉桿菌（Carnobacterium piscicola）LV17[3]、糞腸球菌（Enterococcus faecium）CTC492[4]、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）Lb706[5]、植物乳桿菌（L.plantarum）C11/NC8/J23/J51[6-9]、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）A164[10]、彎曲乳桿菌（L. curvatus）LTH1174[11]、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）La-5[12]、戊糖乳桿菌（L. pentosus）31-1[13]等都發(fā)現(xiàn)了與細菌素合成相關(guān)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。

目前普遍認可乳酸菌細菌素合成相關(guān)群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)由自誘導(dǎo)肽和雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（組氨酸蛋白激酶和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白）組成。自誘導(dǎo)肽作為信號分子，其濃度隨細菌密度增大而增加，當達到臨界濃度時，會激活位于細胞膜上的組氨酸蛋白激酶，使其羧基端所含的一個保守組氨酸殘基位點發(fā)生自我磷酸化。磷酸基團轉(zhuǎn)移至與其相鄰感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白信號輸出區(qū)域的保守天冬氨酸殘基位點，使其發(fā)生磷酸化。磷酸化的感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白可以與目的基因啟動子區(qū)域的DNA結(jié)合位點結(jié)合，從而激活細菌素基因轉(zhuǎn)錄表達[14-16]。

動物雙歧桿菌（Bif i dobacterium animalis）BB04分離自中國新疆于田長壽老人腸道，是國內(nèi)外首次報道的產(chǎn)細菌素動物雙歧桿菌，可代謝合成新型雙歧桿菌細菌素bif i docin A，該細菌素廣譜高效且食品加工適應(yīng)性好，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力，前期課題組已對該細菌素的分子結(jié)構(gòu)、特性、合成條件及抑菌機理進行了系統(tǒng)研究[17-21]。為進一步探討細菌素bifidocin A的生物合成調(diào)控機制，本研究通過分析發(fā)酵過程中菌體密度和細菌素合成的變化趨勢以及檢測發(fā)酵液中有誘導(dǎo)活性的信號分子，探究動物雙歧桿菌BB04代謝產(chǎn)細菌素是否存在群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，并初步明確其自誘導(dǎo)肽分子特性。研究結(jié)果對于全面揭示乳酸菌細菌素在發(fā)酵環(huán)境中的合成調(diào)控行為以及實現(xiàn)調(diào)控細菌素的高效表達具有重要科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

動物雙歧桿菌BB04，分離自中國新疆于田長壽老人腸道[17]；單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 35152 美國典型微生物菌種保藏中心；MRS（Man Rogosa Sharpe）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；改良MRS培養(yǎng)基為在普通MRS培養(yǎng)基中加入0.035%的L-半胱氨酸鹽酸和0.35%的玉米漿。

3 kDa超濾管（15 mL） 美國Millipore公司；Sephadex G25葡聚糖凝膠柱 美國GE公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA purifier100蛋白質(zhì)純化儀 美國GE公司；L C-20A分析型高效液相色譜 日本島津公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀 德國Eppendorf公司；4800 Plus基質(zhì)輔助激光解析電離飛行質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）儀 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體生長及細菌素合成的動態(tài)變化

將動物雙歧桿菌BB04按照1%接種量接種到改良MRS液體培養(yǎng)基中，選擇發(fā)酵起始pH值為7.0，37 ℃培養(yǎng)45 h，期間定期取樣測定其活菌數(shù)、抑菌活性及pH值?；罹嫈?shù)采用亨蓋特厭氧滾管法；抑菌活性檢測以單核細胞性李斯特菌ATCC 35152為敏感指示菌，具體測定方法見參考文獻[17]。

1.3.2 細菌素生物合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)的存在判斷

1.3.2.1 低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系構(gòu)建

為獲得可合成較低水平細菌素的菌株培養(yǎng)模型體系，基于前期對菌株BB04代謝產(chǎn)細菌素培養(yǎng)條件的研究[20]，在接種量（1%）和培養(yǎng)時間（24 h）不變情況下，選擇3 種可以明顯影響細菌素合成的條件（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基起始pH值、培養(yǎng)基濃度（改良MRS培養(yǎng)基稀釋比例））為變量；設(shè)置了12 種不同培養(yǎng)條件組合（表1），通過對菌體生長及細菌素合成變化情況測定分析，確定低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系的培養(yǎng)條件。

表1 實驗設(shè)置的12 種不同培養(yǎng)條件組合Table1 Twelve different combinations of culture conditions

1.3.2.2 發(fā)酵上清液中群體感應(yīng)自誘導(dǎo)肽的檢測

基于1.3.2.1節(jié)中所確定的低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系，添加不同濃度的中和后發(fā)酵上清濃縮液，通過檢測細菌素抑菌活性的變化，分析確定發(fā)酵液上清液中是否存在可誘導(dǎo)細菌素合成的群體感應(yīng)自誘導(dǎo)肽，并初步判斷菌株BB04代謝產(chǎn)細菌素相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)的存在與否。具體包括：1）將動物雙歧桿菌BB04以1%接種量，發(fā)酵起始pH 7.0，37 ℃培養(yǎng)24 h后，8 000 r/min離心10 min獲得發(fā)酵上清液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)其pH值為7.0左右，并通過真空離心濃縮儀獲得中和后發(fā)酵上清液的10 倍（下同）濃縮液，4 ℃貯藏備用；2）培養(yǎng)初期，在低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系分別加入體積分數(shù)為0.2%、1%及2%的中和后發(fā)酵上清濃縮液，在37 ℃共培養(yǎng)誘導(dǎo)24 h，作為實驗組；3）培養(yǎng)末期，在低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系分別加入0.2%、1%及2%的中和后發(fā)酵上清濃縮液，未在培養(yǎng)過程中進行誘導(dǎo)，作為對照組；4）通過檢測比較處理組和對照組以及處理前后細菌素的抑菌活性變化，分析發(fā)酵上清液中是否存在有誘導(dǎo)活性的信號分子；5）以未添加中和后發(fā)酵上清濃縮液且未誘導(dǎo)的低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系為空白組。

1.3.3 發(fā)酵液中自誘導(dǎo)肽的分離提取與鑒定

通過超濾管篩分及葡聚糖凝膠柱層析對發(fā)酵上清液中的自誘導(dǎo)肽進行提取純化，并采用高效液相色譜檢測純化后樣品純度，進而借助MALDI-TOF-MS獲得自誘導(dǎo)肽的分子質(zhì)量信息。具體包括：1）將中和的發(fā)酵上清濃縮液用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾管篩分成兩部分，分子質(zhì)量大于3 000 Da組分和500～3 000 Da組分；并將各組分分別添加到低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系，通過檢測所合成細菌素的抑菌活性，分析各組分是否存在誘導(dǎo)活性；2）將上步中確定有誘導(dǎo)活性的組分進一步通過Sephadex G25柱層析進行純化，通過真空離心濃縮儀回收分離組分，同樣將所分離得到的各個組分分別添加到低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系，通過檢測所合成細菌素的抑菌活性，分析各組分是否有誘導(dǎo)活性；3）將上步中確定有誘導(dǎo)活性的組分進行高效液相色譜檢測，確定樣品純度；4）對達到液相純度的自誘導(dǎo)肽樣品進行MALDITOF-MS檢測分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長及細菌素合成的動態(tài)變化過程

圖1 動物雙歧桿菌BB04的生長曲線及其抑菌活性曲線Fig.1 Production of bacteriocin by strain BB04

動物雙歧桿菌BB04的生長曲線及代謝合成細菌素活性曲線如圖1所示，細菌素bifidocin A在對數(shù)生長期后中期12 h開始產(chǎn)生，并隨著菌體密度增長而持續(xù)增加，當達到24～33 h（穩(wěn)定期）時，細菌素活性達到最高640 AU/mL，之后隨著菌體細胞生長進入衰亡期，菌體細胞開始減少，細菌素活性也隨之減弱。從以上結(jié)果可以看出，當菌體細胞達到一定密度（活菌數(shù)對數(shù)值為7.31）時，細菌素才開始合成；隨著菌體密度的增加，細菌素的合成表現(xiàn)一定的增長相關(guān)性；這表明基于群體感應(yīng)的細胞間交流可能是細菌素bif i docin A合成的主要調(diào)控機制，群體感應(yīng)作為細胞密度函數(shù)，可使細菌素合成保持一定的同步性。

2.2 細菌素生物合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)的存在判斷

2.2.1 低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系模型的構(gòu)建

圖2 不同培養(yǎng)條件對菌體生長及細菌素合成的影響Fig.2 Effects of different culture conditions on the growth of strain BB04 and the production of bacteriocin

分析12 種不同培養(yǎng)條件組合下菌體生長及細菌素合成變化情況，由圖2可以看出，不同培養(yǎng)條件下，菌體密度和細菌素活性變化差異顯著（P＜0.05）；菌體密度和細菌素活性變化趨勢基本同步；在組合8和9條件下，菌株不能代謝產(chǎn)生細菌素；在組合3條件下，菌株可代謝產(chǎn)生較低水平的細菌素，其細菌素抑菌活性僅有93 AU/mL。根據(jù)以上結(jié)果，確定低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)基起始pH 5、培養(yǎng)基1/10改良MRS、接種量1%、培養(yǎng)時間24 h。

2.2.2 發(fā)酵上清液中群體感應(yīng)自誘導(dǎo)肽檢測結(jié)果

圖3 發(fā)酵上清液中自誘導(dǎo)肽的檢測結(jié)果Fig.3 Detection of auto-inducing peptide in the broth supernatant of strain BB04

如圖3所示，添加0.2%、1%及2%的中和后發(fā)酵上清濃縮液但未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組抑菌活性與未添加中和后發(fā)酵上清濃縮液且未誘導(dǎo)空白組抑菌活性基本無變化，效價均在93 AU/mL左右；當添加0.2%中和后發(fā)酵上清濃縮液時，實驗組抑菌活性為115 AU/mL，與未誘導(dǎo)對照組的細菌素活性差異不顯著（P＞0.05）；但當添加量為1%和2%時，實驗細菌素活性分別達到396 AU/mL和484 AU/mL，明顯高于未誘導(dǎo)對照組（P＜0.05），而且隨著添加量的增加，誘導(dǎo)后細菌素活性增加更為明顯。這些結(jié)果都說明，發(fā)酵上清液中存在可以誘導(dǎo)細菌素合成的自誘導(dǎo)肽，而且在一定范圍內(nèi)，自誘導(dǎo)肽含量越高，誘導(dǎo)合成的細菌素越多，活性越強。

2.3 發(fā)酵液中自誘導(dǎo)肽的分離提取與鑒定

為確定發(fā)酵液中自誘導(dǎo)肽的組成，首先用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾管對中和的發(fā)酵上清濃縮液進行初步篩分和誘導(dǎo)活性檢測。由圖4可知，分子質(zhì)量大于3 000 Da組分可以檢測到誘導(dǎo)活性，而500～3 000 Da組分未檢測到誘導(dǎo)活性，卻檢測到了效價為1 280 AU/mL的抑菌活性。這說明自誘導(dǎo)肽存在于分子質(zhì)量大于3 000 Da組分，而細菌素存在于500～3 000 Da組分，這與之前報道的細菌素bifidocin A分子質(zhì)量（1 198.68 Da）一致[17]。接著將分子質(zhì)量大于3 000 Da組分通過葡聚糖凝膠Sephadex G25柱分離，分離得到組分A、B及C（圖5）。對其誘導(dǎo)活性進行檢測，結(jié)果如圖6所示，與未添加任何組分的低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系下細菌素活性（93 AU/mL）相比較，添加組分B但未經(jīng)誘導(dǎo)對照組細菌素活性為92 AU/mL，無明顯變化（P＞0.05），而添加組分B誘導(dǎo)后的細菌素活性明顯增強（P＜0.05），效價可達476 AU/mL。這說明組分B中存在可誘導(dǎo)細菌素合成的信號分子。對組分B進行高效液相色譜檢測，僅檢測到一個峰（圖7），說明樣品純度達到分子質(zhì)量檢測純度要求。

圖4 3 kDa超濾管分離后各組分的誘導(dǎo)活性檢測結(jié)果Fig.4 Activity of fractions separated by 3 kDa ultraf i ltration tubes

圖5 葡聚糖凝膠色譜純化結(jié)果圖Fig.5 Purif i cation of auto-inducing peptide by Sephadex G-25 chromatography

圖6 葡聚糖凝膠分離組分B的誘導(dǎo)活性檢測結(jié)果Fig.6 Activity of fraction B separated by Sephadex G-25 chromatography

圖7 葡聚糖凝膠分離組分B的高效液相色譜檢測結(jié)果圖Fig.7 Purif i cation of auto-inducing peptide by HPLC

圖 8 自誘導(dǎo)肽的MALDI-TOF-MS圖Fig.8 Mass spectrum for auto-inducing peptide by MALDI-TOF-MS

如圖8所示，液相色譜純度的自誘導(dǎo)肽樣品經(jīng)MALDI-TOF-MS在m/z 500～4 500掃描范圍內(nèi)測定，分析得到細菌素bifidocin A生物合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)自誘導(dǎo)肽的分子質(zhì)量為3 587.253 Da。前期研究中已經(jīng)確定細菌素的分子質(zhì)量為1 198.68 Da[17]。這說明細菌素bif i docin A生物合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)自誘導(dǎo)肽不是細菌素本身。已報道部分細菌素的自誘導(dǎo)肽同樣不是細菌素本身，如張香美等[22]鑒定細菌素pentocin 31-1合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)自誘導(dǎo)肽分子質(zhì)量為2 985.16 Da，不同于細菌素（5 592.25 Da）；Maldonado-Barragan等[23]則發(fā)現(xiàn)細菌素plantaricin NC8的自誘導(dǎo)肽是由pln8IF基因編碼的多肽，不同于細菌素編碼結(jié)構(gòu)基因。然而，細菌素nisin和plantaricin A的自誘導(dǎo)肽卻是細菌素本身[24-25]。這些結(jié)果表明，不同細菌素相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)自誘導(dǎo)肽分子具有特異性，對于自誘導(dǎo)肽的檢測很難建立通用方法。

3 討 論

對多數(shù)菌株而言，群體感應(yīng)系統(tǒng)是乳酸菌細菌素合成的主要調(diào)控機制。自誘導(dǎo)肽是啟動細菌素群體感應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵信號分子，也是判斷細菌素群體感應(yīng)系統(tǒng)存在的重要指標。目前，對自誘導(dǎo)肽組成及誘導(dǎo)活性的主要研究方法是在低于感應(yīng)密度條件下，構(gòu)建不產(chǎn)細菌素表型的培養(yǎng)物模型，或在較低感應(yīng)密度條件下，構(gòu)建低產(chǎn)細菌素表型培養(yǎng)物模型，并分別添加不同分子質(zhì)量大小發(fā)酵液濃縮組分檢測細菌素合成量及活性，分析鑒定可誘導(dǎo)合成細菌素的活性組分，初步判定細菌素群體感應(yīng)系統(tǒng)的存在，進而參照多肽的提純、分子質(zhì)量、氨基酸序列及高級結(jié)構(gòu)測定方法獲得高純度自誘導(dǎo)肽并分析其分子結(jié)構(gòu)[26-27]。張香美等[22]鑒定細菌素pentocin 31-1合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)自誘導(dǎo)肽分子質(zhì)量為2 985.16 Da；Nilsen等[4]基于以上研究思路確定細菌素enteriocin A合成受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，其自誘導(dǎo)肽EntF由25 個氨基酸組成，部分氨基酸序列為TLPGGLPASALVGPV。本研究通過構(gòu)建低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)物模型，初步確定細菌素bif i docin A存在生物合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)，并鑒定其自誘導(dǎo)肽為3 587.253 Da多肽。該自誘導(dǎo)肽不是細菌素本身，也不同于目前已報道其他細菌素的自誘導(dǎo)肽[22-25]，表明不同細菌素合成相關(guān)自誘導(dǎo)肽存在特異性，不同細菌素合成相關(guān)群體感應(yīng)系統(tǒng)存在多樣性。

此外，已有研究證據(jù)顯示，部分環(huán)境條件可以通過調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)影響細菌素的合成與表達。Verluyten等[11]研究了高濃度NaCl對細菌素合成的影響，發(fā)現(xiàn)2%NaCl在不影響細胞生長情況下就可抑制細菌素的合成，推測NaCl的添加可影響自誘導(dǎo)肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或減少其合成或通過與雙組份受體結(jié)合而干擾自誘導(dǎo)肽發(fā)揮誘導(dǎo)作用；然而張甲慶[27]則研究發(fā)現(xiàn)2% NaCl脅迫條件可促進植物乳桿菌KLDS1.0391合成細菌素能力，并推測NaCl的添加可增強自誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)活性進而促進細菌素編碼基因plnEF的表達水平；Ruiz-Barba等[28]發(fā)現(xiàn)在綠橄欖發(fā)酵過程通過共培養(yǎng)E. faecium 6T1a-20和P. pentosaceus FBB63可以促進L. plantarum NC8代謝產(chǎn)細菌素，并增強菌株對發(fā)酵環(huán)境脅迫條件的適應(yīng)能力。以上表明，不同環(huán)境脅迫條件對細菌素合成影響差異較大，甚至在相同脅迫條件下，不同菌株代謝產(chǎn)細菌素的表現(xiàn)也各不相同，但這些環(huán)境因素是如何對自誘導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)與功能以及自誘導(dǎo)肽與雙組分相互作用產(chǎn)生影響的機制等科學(xué)問題并不明確。未來加強乳酸菌細菌素的群體感應(yīng)合成調(diào)控機理以及環(huán)境條件對群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響機制研究，不僅對提高乳酸菌細菌素的產(chǎn)量具有重要作用，而且對研究乳酸菌在不良生長環(huán)境中的適應(yīng)競爭機制及其代謝調(diào)控也具有重要意義[29]。

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