徐曉東，宋 澤，馮 濤，宋詩清*，孫 敏，姚凌云

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

草菇又名蘭花菇、苞腳菇，是一種重要的熱帶亞熱帶菇類。目前，全球栽培最多的6 種食用菌里就有草菇[1]。我國草菇產(chǎn)量占全世界總產(chǎn)量的70%～80%，居世界之首[2]。2013年我國草菇產(chǎn)量為31.1萬 t，2014年產(chǎn)量為33.5萬 t，占同期國內(nèi)食用菌總產(chǎn)量的1.1%。草菇營養(yǎng)豐富，味道鮮美，富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸，其中必需氨基酸含量占40.47%～44.47%[3]。組成食用菌蛋白的氨基酸中含有高比例的谷氨酰胺和谷氨酸，一級結(jié)構(gòu)中富含鮮味肽序列，是生產(chǎn)高品質(zhì)呈味基料的優(yōu)質(zhì)原料[4]。

食用菌的滋味是由豐富多樣的風(fēng)味物質(zhì)引起的，主要分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性兩類。非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是一些可溶性糖及糖醇、有機(jī)酸、游離氨基酸以及5’-核苷酸等[5-6]。近年來，國內(nèi)外研究者對草菇等食用菌的研究主要集中在多糖、貯藏保鮮及初級調(diào)味品開發(fā)等研究方面，例如研究不同方法提取草菇多糖體外抗氧化活性[7]、草菇多糖的分離純化和生物活性[8]、草菇貯藏過程中抗氧化酶活力的變化[9]、分析食用菌中的呈味物質(zhì)及鮮味評價[10-11]，但研究不同提取方法對草菇呈味物質(zhì)釋放的影響鮮見報道。本實驗以可溶性糖及糖醇、有機(jī)酸、5’-核苷酸、游離氨基酸組成和含量、分子質(zhì)量分布為指標(biāo)，研究常壓蒸煮、高壓蒸煮以及酶解處理3 種預(yù)處理方法對草菇呈味物質(zhì)釋放的影響，為食用菌調(diào)味料的開發(fā)及風(fēng)味增強(qiáng)肽產(chǎn)品的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草菇成熟子實體采自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗基地。

纖維素酶（20 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（20 000 U/g）、食用菌水解酶（2 000 U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；海藻糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、甘露醇、5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 日本W(wǎng)ako公司；其他試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS2500型離子色譜儀、Carbo Pac PA-20陰離子交換分析柱、Carbo Pac MA-1陰離子交換柱 美國Dionex公司；600高效液相色譜儀 美國Waters公司；Ultimate AQ-C18色譜柱 上海月旭材料科技有限公司；Green ODS-AQ C18色譜柱 上海易創(chuàng)儀器分析有限公司；ATN-300全自動凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；754PC紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱 HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BF00A粉碎機(jī) 上海淀久機(jī)械制造有限公司；Milli-Q超純水設(shè)備 美國Ultra公司。

1.3 方法

1.3.1 原料前處理

所采集的草菇用流動自來水沖洗后，一部分用于測定水分含量，另一部分用粉碎機(jī)打磨成勻漿，-18 ℃冷凍備用。

1.3.2 草菇樣品的不同處理

1.3.2.1 草菇酶解液的制備

稱取100 g勻漿樣品，按料液比1∶40（g/mL）加入去離子水，在pH 3.5、溫度45 ℃條件下，加入纖維素酶0.5 g，酶解1.5 h；然后調(diào)節(jié)pH值為6.0，溫度為50 ℃，加入風(fēng)味蛋白酶0.4 g，繼續(xù)酶解1.5 h，升溫至90 ℃滅酶5 min后，7 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液備用。

1.3.2.2 草菇常壓蒸煮液的制備

稱取100 g勻漿樣品，按料液比1∶1.5（g/mL）加入去離子水，100 ℃蒸煮2 h，蒸煮液冷卻后，7 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液備用。

1.3.2.3 草菇高壓蒸煮液的制備

稱取100 g勻漿樣品，按料液比1∶1.5（g/mL）加入去離子水，在40 kPa壓力下蒸煮1.5 h，蒸煮液冷卻后，7 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液備用。

1.3.3 指標(biāo)的測定

1.3.3.1 新鮮草菇中的水分、總糖、粗蛋白、粗脂肪含量測定

對洗凈的鮮菇的水分、總糖、粗蛋白和粗脂肪含量進(jìn)行檢測。水分含量的檢測采用烘箱法，參照文獻(xiàn)[12]?？偺堑臋z測采用苯酚-硫酸法，參照文獻(xiàn)[13]。粗蛋白的檢測采用凱氏定氮法，參照文獻(xiàn)[14]。粗脂肪含量測定采用酸水解法，參照文獻(xiàn)[15]。

1.3.3.2 可溶性糖測定

可溶性糖的提取參考Ajlouni等[16]的方法。分別稱取1 g制備樣，加入50 mL 80%乙醇溶液，搖勻后于30 ℃搖床振搖45 min，抽濾。將濾渣用80%乙醇溶液沖洗3 次，取濾液于55 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，超純水定容至10 mL。將樣品12 000 r/min離心10 min后進(jìn)行稀釋，上清液過0.22 μm混合纖維素酯（mixed cellulose ester，MCE）微孔濾膜上機(jī)測試。

可溶性糖含量的測定：單糖：Carbo Pac PA-20陰離子交換分析柱（150 mm×3 mm）；柱溫30 ℃；流動相為純水和0.25 mol/L NaOH溶液，流速為0.45 mL/min，進(jìn)樣量25 μL；可溶性糖醇：Carbo Pac MA-1陰離子交換柱（4 mm×250 mm）；柱溫30 ℃；流動相為0.48 mol/L NaOH溶液，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量25 μL。

1.3.3.3 有機(jī)酸測定

分別稱取1 g制備樣，加入50 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，60 ℃振搖60 min提取有機(jī)酸。待冷卻后將提取液12 000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm MCE微孔濾膜用高效液相色譜儀檢測。色譜條件：Green ODS-AQ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為10 mmol/L KH2PO4緩沖鹽溶液，pH 2.8，流速1.0 mL/min；紫外檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。通過標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間及峰面積建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中相應(yīng)物質(zhì)的含量。

1.3.3.4 游離氨基酸測定

采用OPA FMOC柱前衍生化法測定[17]。色譜條件：ODS HYPERSIL色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流速1 mL/min。流動相：A相：8.0 g乙酸鈉溶于1 000 mL水中，再加入225 μL三乙胺，攪拌并滴加5%的醋酸溶液，將pH值調(diào)至7.2，加入5 mL四氫呋喃，混合后備用。B相：8.0 g乙酸鈉溶于400 mL水中，滴加2%醋酸溶液將pH值調(diào)至7.2，將此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后備用。洗脫程序：0～17.0 min，B相0%～60%；17.0～18.0 min，B相60%～100%；18～23 min，B相100%。

1.3.3.5 5’-核苷酸測定

5’-核苷酸的提取參考Taylor等[18]方法。分別稱取1 g制備樣，加入25 mL蒸餾水，煮沸1 min，冷卻至室溫后于12 000 r/min離心15 min，取出上清液，廢渣以相同方法重提一次，合并上清液，定容至50 mL。取定容后的上清液過0.22 μm MCE微孔濾膜，由高效液相色譜儀進(jìn)行5’-核苷酸含量的檢測。色譜條件：Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相10 mmol/L KH2PO4緩沖液（pH 4.68），檢測波長259 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。通過標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間及峰面積建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中相應(yīng)物質(zhì)的含量。

1.3.3.6 分子質(zhì)量的分布測定

采用高效液相色譜法。色譜條件：TSKgel 2000 SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm）；流動相：乙腈-水-三氟乙酸體積比45∶55∶0.1；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗每個樣品做3 次平行，數(shù)值以 ±s表示，由SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行顯著性分析，分析方法為最小顯著極差法（least significant rang，LSR），顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方法對草菇可溶性糖及糖醇含量的影響

新鮮草菇的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)82.4%，總糖、粗脂肪、粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為35.1%、1.24%、24.3%。食用菌中小分子可溶性糖及糖醇是其甜味的主要來源[19]，但并不是食用菌特有的風(fēng)味。由表1可知，草菇中含量最高的是海藻糖，占可溶性糖總量的50%以上。海藻糖是食用菌中的一種特有的糖，是一種低致齲性甜味劑[20]，因為其溫和的甜度、穩(wěn)定的性能及良好的保濕效果，海藻糖近些年來常被用于食品或飲料中[21]。甘露醇是唯一能檢測到的糖醇，是草菇的主要糖醇類物質(zhì)，其能量是糖的一半，由于其不容易被人體吸收，因此不會像糖一樣增加太多胰島素水平，也不易引起蛀牙[22]。

表1 草菇原液及不同制備液的可溶性糖及糖醇含量Table1 Contents of soluble sugar and sugar alcohol of mushroom homogenate before and after different treatments

和原液相比，常壓蒸煮制備液可溶性糖的總量顯著降低，主要原因可能是還原糖參與美拉德反應(yīng)導(dǎo)致的；高壓蒸煮制備液可溶性糖的總量和草菇原液基本相同，雖然高壓蒸煮過程中也伴隨有美拉德反應(yīng)，但高壓使得細(xì)胞破壞程度更大，釋放了某些糖類，推測糖的釋放量和參與反應(yīng)的量相當(dāng)，導(dǎo)致可溶性糖的總量基本不變，其中海藻糖、阿拉伯糖和甘露糖的含量明顯增加，巖藻糖、鼠李糖及葡萄糖含量顯著降低。和原液相比，由纖維素酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解作用極顯著地提高了可溶性糖的總量，主要表現(xiàn)為葡萄糖含量的明顯增加，原因可能是由于纖維素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纖維素生成葡萄糖的一種酶，所以導(dǎo)致酶解物中葡萄糖含量顯著增加。

2.2 不同處理方法對草菇中有機(jī)酸含量的影響

表2 草菇原液及不同制備液的有機(jī)酸含量Table2 Content of organic acids of mushroom homogenate before and after different treatments

如表2所示，和原液相比，常壓蒸煮制備液有機(jī)酸總量顯著增加，特別是乙酸和丁二酸。乙酸具有特殊味道，能對人的舌后部產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激[23]，丁二酸鈉鹽是鮮味的主要呈味成分。酒石酸和富馬酸的含量稍有增加，酒石酸存在于多種植物中，特別是葡萄中含量很多[24]，常用于制造飲料；富馬酸具有類似水果味，可作為酸味劑，用于清涼飲料、水果糖、果凍、冰淇淋等，大多與檸檬酸并用。蘋果酸的含量稍有降低，檸檬酸的含量顯著降低，檸檬酸具有清新的、新鮮的酸味，但這種味道和蘋果酸不同。

和原液相比，高壓蒸煮制備液有機(jī)酸總量增加顯著，其中乙酸和丁二酸含量也顯著增加，酒石酸、蘋果酸和富馬酸的含量稍有增加，檸檬酸的含量顯著降低；同時高壓蒸煮也檢測到乳酸的存在。相反，復(fù)合酶解制備液有機(jī)酸總量顯著降低，其原因是蘋果酸和檸檬酸的含量顯著降低所致。無論蒸煮還是酶解，都對草菇組織中有機(jī)酸的釋放有促進(jìn)作用，對于含量降低的有機(jī)酸其原因可能是參與了化學(xué)反應(yīng)所致。

2.3 不同處理方法對草菇中的游離氨基酸及5’-核苷酸的影響

表3 草菇原液及不同制備液的游離氨基酸及5’-核苷酸含量Table3 Contents of free amino acids and 5’-nucleotides of mushroom homogenate before and after different treatments

游離氨基酸是食用菌中重要的鮮味活性物質(zhì)。由表3可知，常壓蒸煮、高壓蒸煮和復(fù)合酶解作用后的游離氨基酸總量均有所增加。3 種處理方法相比，蒸煮獲得的游離氨基酸更多，尤其是高壓蒸煮，其主要原因是高溫高壓對植物細(xì)胞壁的降解作用更劇烈，使更多的游離氨基酸釋放出來。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸的含量在經(jīng)過不同處理之后都有所增加，以高壓蒸煮制備液增加的最顯著。天冬氨酸和谷氨酸是草菇中主要的呈鮮物質(zhì)，亮氨酸和脯氨酸是參與美拉德反應(yīng)、產(chǎn)生呈味物質(zhì)的重要前體物[25]。

根據(jù)氨基酸的呈味特性，將其分為鮮味、甜味、苦味以及無味4 種，鮮味氨基酸：天冬氨酸+谷氨酸；甜味氨基酸：蘇氨酸+絲氨酸+甘氨酸+丙氨酸+脯氨酸；苦味氨基酸：纈氨酸+甲硫氨酸+異亮氨酸+亮氨酸+苯丙氨酸+組氨酸+精氨酸；無味氨基酸：半胱氨酸+酪氨酸+賴氨酸，分別計算其含量，結(jié)果如表4所示。

表4 游離氨基酸分類及含量Table4 Types and contents of free amino acids in mushroom homogenate before and after different treatments

谷氨酸與食鹽結(jié)合形成L-谷氨酸鈉是鮮味的代表物質(zhì)，也是味精的主要成分，雖然天冬氨酸鈉鹽的鮮味程度低于L-谷氨酸鈉的10%[26]，但是仍具有明顯的鮮味，通常把天冬氨酸和谷氨酸均歸類為鮮味氨基酸，由表4可知，二者總量約占游離氨基酸總量的20%。丙氨酸是重要的甜味氨基酸，與谷氨酸等鮮味物質(zhì)相互作用具有提鮮效果[27]，常壓蒸煮、高壓蒸煮和復(fù)合酶分步作用后的丙氨酸含量都有所增加，其中以高壓蒸煮最為明顯。高壓蒸煮制備液的鮮味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸的含量都增加的最顯著。

草菇中只檢測出5’-鳥苷酸，是對鮮味有貢獻(xiàn)的呈味核苷酸，5’-鳥苷酸與L-谷氨酸鈉有強(qiáng)烈的增鮮協(xié)同作用，其增鮮程度最高可達(dá)到單獨使用L-谷氨酸鈉的30 倍[28]。2 種蒸煮處理均使5’-鳥苷酸含量有所增加，高壓蒸煮增加的更明顯，而酶解處理顯著降低了呈味核苷酸的含量，這可能是由于酶解使得部分核苷酸受到破壞。

2.4 不同處理方法對草菇中肽分子質(zhì)量分布的影響

表5 草菇原液及不同制備液的肽分子質(zhì)量分布Table5 Molecular mass distribution of peptides in mushroom homogenate before and after different treatments

由表5可以明顯看出，不同提取方法得到的制備液中肽的分子質(zhì)量分布明顯不同。和原液相比，常壓蒸煮、高壓蒸煮和酶解作用后，小于500 Da組分的含量都有增加，高壓蒸煮制備液增加的最顯著，這是因為高溫高壓的條件使得大分子分解成小分子的程度大。

氨基酸的分子質(zhì)量一般都小于500 Da，即3 種不同提取方法處理后，氨基酸的含量都有所增加，以高壓蒸煮的增加最為明顯，這與游離氨基酸的分析結(jié)果一致。另外，食用菌味道鮮美是源于其含有許多鮮味物質(zhì)，呈味肽就是一類重要的風(fēng)味物質(zhì)，呈味肽是一類分子質(zhì)量小于3 000 Da的寡肽[29]，這類肽組分可與舌頭味蕾上某一味道的特異性受體相互作用，呈現(xiàn)特征滋味[30]。由表5可以看出，高壓蒸煮制備液中，小于3 000 Da的組分含量最多，因此，通過高壓蒸煮獲得呈味肽是有效途徑之一。

3 結(jié) 論

經(jīng)過常壓蒸煮、高壓蒸煮、復(fù)合酶解3 種不同提取方法獲得的制備液，呈味物質(zhì)都有一定的變化，3 種不同的提取方法對草菇呈味物質(zhì)釋放的影響不盡相同。和原液相比，常壓蒸煮制備液可溶性糖的總量顯著降低，這可能是還原糖參與美拉德反應(yīng)導(dǎo)致的；高壓蒸煮制備液可溶性糖的總量和草菇原液基本相同；而由纖維素酶和風(fēng)味蛋白酶分步酶解作用顯著地提高了可溶性糖的總量，主要表現(xiàn)為葡萄糖含量的明顯增加。從有機(jī)酸的變化來看，和原液相比，常壓及高壓蒸煮制備液有機(jī)酸總量顯著增加，尤其是高壓蒸煮；而復(fù)合酶解制備液有機(jī)酸含量顯著降低，主要是由其蘋果酸和檸檬酸的含量顯著降低所致。從游離氨基酸總量上看，不同方法處理后的游離氨基酸總量都有所增加。3 種處理方法相比，蒸煮獲得的游離氨基酸更多，尤其是高壓蒸煮，這主要是因為高溫高壓對植物細(xì)胞壁的降解作用更劇烈，使更多的游離氨基酸釋放出來。其中高壓蒸煮制備液的鮮味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸的含量都增加的最為顯著。草菇中只檢測出5’-鳥苷酸對鮮味有貢獻(xiàn)的呈味核苷酸，2 種蒸煮處理都使5’-鳥苷酸含量有所增加，高壓蒸煮增加的更明顯，而酶解處理顯著降低了呈味核苷酸的含量。不同提取方法得到的制備液中肽的分子質(zhì)量分布明顯不同。和原液相比，常壓蒸煮、高壓蒸煮和酶解作用后，小于500 Da組分的含量都有增加，以高壓蒸煮的增加最為明顯。高壓蒸煮制備液中，小于3 000 Da的組分含量最多，是制備呈味肽有效的處理方法之一。

綜上，本實驗通過研究不同處理方法對草菇中呈味物質(zhì)釋放的影響，為草菇深加工產(chǎn)品的開發(fā)以及食用菌調(diào)味料的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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