王曉軍，吳 婷，賈 偉，張春暉，韓 玲*，余群力

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

膠原蛋白是一種纖維狀蛋白質(zhì)，是生物體重要的結(jié)構(gòu)蛋白，大約占體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的25%，在保健品、生物藥品、化妝品及食品行業(yè)中都有著廣泛的應(yīng)用[1]。膠原蛋白種類很多，根據(jù)其結(jié)構(gòu)差異，目前已知的超過30 種，分別被命名為I型、II型、III型[2]。I型膠原蛋白由2 條相同的α1多肽鏈和1 條與α1鏈氨基酸組成不同的α2鏈組成；2 條α鏈聚合形成β鏈，3 條α鏈構(gòu)成的三螺旋結(jié)構(gòu)為γ鏈，然后又相互纏繞成超螺旋結(jié)構(gòu)[3-4]。I型膠原蛋白主要存在于動物的骨、肌腱、皮膚、韌帶及許多間質(zhì)結(jié)締組織中。

目前已有不少關(guān)于提取膠原蛋白的研究報道，溫慧芳等[5]采用堿法、鹽法、熱水法、酸法與酶法提取鮰魚皮中的膠原蛋白，并對提取的膠原蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明酸法、酶法和熱水法提取的膠原蛋白均為I型膠原蛋白，并保留了較好蛋白結(jié)構(gòu)。劉蘇銳等[6]采用酸膨脹-胃蛋白酶降解法用豬皮制備膠原蛋白，提取的I型膠原蛋白很好地保持了天然膠原的螺旋結(jié)構(gòu)。何蘭[7]以牛骨為原料提取膠原蛋白，結(jié)果表明牛長骨中提取的酸溶性膠原蛋白及酶溶性膠原蛋白中甘氨酸約占氨基酸總量的1/3，為典型I型膠原蛋白，且存在完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。劉靜[8]以牦牛骨粉為原料制備牦牛骨膠原多肽，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對酶進(jìn)行篩選并優(yōu)化酶解條件得到酶解法制備的牦牛骨膠原多肽。膠原蛋白的研究很多，但牦牛骨中膠原蛋白的研究較少。我國是牦牛種群和數(shù)量最多的國家，占世界牦?？倲?shù)的92%以上[9-10]，但大量的研究都集中于不同品種地域牦牛肉的營養(yǎng)成分、產(chǎn)肉產(chǎn)乳性能以及相關(guān)的分子生物學(xué)方面，忽略了牛骨這一副產(chǎn)物的研究開發(fā)，大量的牦牛骨未被充分利用，造成資源的浪費(fèi)和流失。牦牛骨內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及其他微量元素[11]，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占到20%～30%，且主要為膠原蛋白[12]。

本實(shí)驗(yàn)采用酸法和酶法分別從牦牛骨中提取膠原蛋白，并且通過對比分析這2 種方法所提取膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征，驗(yàn)證了這2 種方法提取牦牛骨膠原蛋白的可行性，確定了牦牛骨膠原蛋白的類型，為牦牛骨的利用和膠原蛋白高值化產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青海牦牛骨（采自自然放牧條件下，發(fā)育正常、健康無病、3～4 歲齡牦牛） 青海省海北藏族自治州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所。

AAS18氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 美國Thermo公司；丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)R-250、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、胃蛋白酶（1 200 U/g）、其他試劑（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；DGF30-IA型電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京試驗(yàn)儀器廠；L-8900氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 瑞士Bruker公司；Q200差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀 美國TA公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 荷蘭FEI公司；Mini-protein垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；X-12R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；BS214D電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白提取工藝流程

牦牛骨→去除殘余肉及表面雜質(zhì)→脫脂→乙二胺四乙酸脫鈣→0.5 mol/L乙酸溶液提?。ɑ?.5 mol/L的乙酸溶液以及1.6%胃蛋白酶提?。}析→離心→乙酸復(fù)溶→透析→蒸餾水透析→真空冷凍干燥

1.3.2 酸法提取

脫脂脫鈣完全后，用0.5 mol/L的冰醋酸溶液以質(zhì)量比1∶10溶解，振搖浸提1～5 d，收集上清液，采用鹽析的原理使溶液中的膠原蛋白沉淀析出。向上述上清液中加入Tris（6 g/L提取液），pH 7.5，調(diào)至最佳鹽析濃度，攪拌均勻靜置過夜后，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，將沉淀物凍干即得酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）粗品[13]。通過3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按下式計算膠原蛋白得率，ACS的得率為（2.24±0.3）%。

1.3.3 酶法提取

脫脂脫鈣完全后，同時加入0.5 mol/L的乙酸溶液和1.6%（按牛骨原料質(zhì)量計）胃蛋白酶（1 200 U/g）。牛骨與乙酸溶液質(zhì)量比為1∶10，振搖浸提1～5 d。收集上清液并加入Tris（6 g/L提取液），調(diào)節(jié)pH 7.5，加熱至90 ℃以上滅酶10 min，調(diào)至最佳鹽析濃度，攪拌均勻靜置過夜后，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，將沉淀物凍干即得酶溶性膠原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）粗品[13]。通過3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按1.3.2節(jié)計算膠原蛋白得率，PSC得率為（3.32±0.4）%。

1.3.4 透析

將膠原蛋白粗品使用0.5 mol/L冰醋酸復(fù)溶，然后依次用0.1 mol/L冰醋酸溶液和蒸餾水進(jìn)行透析。透析結(jié)束將沉淀物凍干即得相對較純的膠原蛋白樣品，貯存待測。

1.3.5 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)分析

1.3.5.1 氨基酸組成與含量分析

取約50 mg膠原蛋白，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液，110 ℃水解24 h；酸水解后過濾，將濾液定容至50 mL；取1 mL氮吹至干，再向其中加入5 mL 0.02 mol/L HCl溶液復(fù)溶，振蕩混勻，用0.20 μm的濾膜過濾，用氨基酸自動檢測儀進(jìn)行測定。

1.3.5.2 牦牛骨膠原蛋白紫外光譜分析

參考Caputo等[14]方法稍有改動，用蒸餾水溶解凍干的骨膠原蛋白樣品并配制成2 mg/mL溶液，常溫下用紫外-可見分光光度計在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，波長間隔1 nm，蒸餾水為空白。

1.3.5.3 牦牛骨膠原蛋白FTIR分析

采用FTIR對牦牛骨膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的組成進(jìn)行分析，參考倪娜等[15]的方法，并稍作修改。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，以空氣為背景，將凍干樣品完全覆蓋檢測器進(jìn)行測定，獲取樣品FTIR圖。

1.3.5.4 熱收縮溫度的測定

采用DSC法測定牦牛骨膠原蛋白的熱收縮溫度。取約10 mg樣品于鋁制坩堝中，加蓋后壓片密封，以空鋁制坩堝作為參比。25 ℃保持1 min，從25 ℃升溫至100 ℃，100 ℃保持1 min，升溫速率為2 ℃/min。

1.3.5.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）分析

參考Laemmil[16]的方法并稍作修改，將樣品于0.5 mol/L的乙酸溶液中溶解后調(diào)至中性，按1∶1的比例與上樣緩沖液混合后，沸水浴3～5 min，冷卻后進(jìn)行離心，取上清液10 μL上樣。濃縮膠4%，分離膠12%。采用直壓恒流電源，濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓110 V，結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色40 min，脫色后觀察分析。1.3.5.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察

用SEM觀察牦牛骨膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，參考Palka等[17]的方法并稍作修改。取適量形狀規(guī)則的凍干牦牛骨膠原蛋白樣品，經(jīng)真空離子鍍膜儀噴金后進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，所有數(shù)據(jù)以 ±s表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成與含量分析

表1 青海牦牛骨膠原蛋白氨基酸含量Table1 Amino acid composition of two collagens

由表1可知，青海牦牛骨ASC和PSC中特征性氨基酸（Gly、Pro、Hyp）總量分別為277.9、297.5 mg/g；Gly含量最多，分別占總氨基酸的25.5%和24.6%，因?yàn)槟z原蛋白多肽鏈的很長區(qū)段序列由Gly-X-Y氨基酸序列重復(fù)而組成，從而Gly的含量較高[18]；Hyp作為膠原蛋白的特征氨基酸，對肽鏈間氫鍵的形成起到促進(jìn)作用，氫鍵又能維持膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，與膠原蛋白的熱穩(wěn)定性相關(guān)[19]；ASC和PSC中均不含有Trp，且Cys、His和Thr的含量較低；除Cys、Val、Met外，青海牦牛骨PSC中的其他氨基酸含量均高于ASC。I型膠原蛋白中Gly、Pro和Hyp含量豐富，且Gly約占氨基酸總量的1/3，Cys、His、Thr和Trp的含量很低甚至沒有[20]，因此推斷牦牛骨ASC、PSC為I型膠原蛋白，且PSC的純度相對較高。

2.2 紫外光譜分析

圖1 青海牦牛骨膠原蛋白紫外光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of ASC and PSC

蛋白質(zhì)分子中存在一些在紫外吸收區(qū)域有特征吸收的官能團(tuán)，例如芳香族氨基酸殘基一般在250～280 nm波長范圍產(chǎn)生一個吸收峰；氨基酸殘基、氫鍵或與螺旋等構(gòu)象相關(guān)的次級鍵一般在210～250 nm的波長范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收峰；而蛋白質(zhì)分子中的肽鍵及某些與蛋白質(zhì)構(gòu)象相關(guān)因素一般會在210 nm波長以下產(chǎn)生吸收峰[21-22]。如圖1所示，牦牛骨ASC和PSC兩種膠原蛋白樣品的紫外光譜特征基本一致，均在234 nm波長處達(dá)到最大吸收，與相關(guān)文獻(xiàn)報道的在230 nm波長處具有最大吸光度相吻合，主要是肽鍵—C＝O的n→π*躍遷，是膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[23-24]。

2.3 FTIR分析

使用Peakfit 4.2軟件對ASC和PSC紅外譜圖中酰胺I帶進(jìn)行高斯擬合，得到多個子峰，進(jìn)行峰位指認(rèn)，各子峰峰位的譜帶歸屬參考Choi等[25]的報道，將1 616～1 637 cm-1和1 681～1 700 cm-1歸屬為β-折疊，1 638～1 645 cm-1歸屬為無規(guī)則卷曲，1 646～1 664 cm-1歸屬為α-螺旋，1 665～1 681 cm-1歸屬為β-轉(zhuǎn)角，并計算二級結(jié)構(gòu)相對含量。

圖2 青海牦牛骨膠原蛋白FTIR圖Fig.2 FTIR spectra of ASC and PSC

圖3 青海牦牛骨膠原蛋白中二級結(jié)構(gòu)的相對含量Fig.3 Secondary structure composition of ASC and PSC

圖2 為ASC與PSC的FTIR，經(jīng)曲線擬合去卷積及峰位指認(rèn)分析，二級結(jié)構(gòu)相對含量如圖3顯示，青海牦牛骨ASC中的α-螺旋（66.7%）含量為PSC中的2.0 倍，ASC與PSC中的β-折疊分別為29.5%、41.2%，β-轉(zhuǎn)角分別為3.8%和25.4%，二者均不含無規(guī)則卷曲，表明青海牦牛骨ASC和PSC三股螺旋結(jié)構(gòu)完整。對特征吸收峰分析如表2所示。

表2 ASC和PSC特征吸收峰及產(chǎn)生原因[26-27]Table2 FTIR spectral peak locations and assignment of ASC and PSC[26-27]

由表2可知，青海牦牛骨ASC和PSC在3 400 cm-1左右為酰胺A帶，是蛋白質(zhì)的特征吸收峰；酰胺I帶均出現(xiàn)在1 651.01 cm-1左右，是由膠原蛋白多肽骨架中C—O的伸縮振動所導(dǎo)致，與其二級結(jié)構(gòu)有關(guān)；1 450～1 600 cm-1是酰胺II帶的特征吸收頻率，ASC僅在1 579.65 cm-1出現(xiàn)吸收峰；膠原蛋白中的Gly、Pro、Hyp含量相對較高，因此牦牛骨ASC和PSC在1 200～1 400 cm-1處具有獨(dú)特的吸收峰，由C—N的伸縮振動和N—H的彎曲振動所引起，可以歸屬于Gly骨架和Pro側(cè)鏈上CH2的搖擺振動峰；膠原蛋白紅外光譜特征綜合表明所提取的ASC和PSC保留了較為完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4 DSC分析

圖4 青海牦牛骨膠原蛋白熱流分析Fig.4 Thermal analysis of ASC and PSC

通過DSC法分析青海牦牛骨ASC、PSC的熱收縮溫度（Ts）和變性焓值（denaturation enthalpy，DH）。加熱會使膠原蛋白超螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵斷裂，變性則形成無規(guī)則卷曲，并伴隨著能量變化，同時也可以反映膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)及其生物活性的變化[28]。由圖4可以看出，青海牦牛骨ASC和PSC的Ts分別是40.12 ℃和40.94 ℃，DH分別為0.25 J/g和0.22 J/g。推測這可能是因?yàn)殛笈９茿SC和PSC的提取溫度相同，所以兩者的Ts和DH無太大差別。

2.5 SDS-PAGE結(jié)果

如圖5所示，PSC和ASC的基本組成大致相同，在高于250 kDa處是I型膠原蛋白α鏈的三聚體，即γ鏈，約200 kDa處有一條β條帶，為α鏈的二聚體；在約110 kDa處有α1、α2兩條電泳條帶，與劉麗莉等[29]報道的一致。因此，判定所提取的膠原蛋白基本具有較為完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。有研究表明高分子質(zhì)量的γ與β鏈含量越高，膠原蛋白的凝膠強(qiáng)度就越低[30]，ASC的γ鏈和β鏈較淺較細(xì)，PSC的γ鏈較為明顯，β鏈較多，表明ASC的凝膠性可能相對較好；ASC的α鏈條帶相對淺細(xì)且無70 kDa以下的條帶，可能是因?yàn)锳SC的蛋白結(jié)構(gòu)相對更完整，幾乎不含有小分子的水解膠原蛋白及多肽；而PSC的α鏈以下有其他分子鏈條，說明在酶法提取的過程中，在酶的作用下可能使膠原蛋白降解成其他小分子，由此推斷酸法提取的膠原蛋白比酶法提取的膠原蛋白的純度更高。

圖5 青海牦牛骨膠原蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis of ASC and PSC

2.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

圖6 青海牦牛骨膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructures of ASC (A) and PSC (B)

對牦牛骨中提取的ASC與PSC進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果如圖6所示。ASC和PSC呈現(xiàn)出相對均一規(guī)則且光滑的多孔網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，其孔徑的大小可能與制備過程中的含水量有關(guān)[7,31]。其中，ASC結(jié)構(gòu)分布相對均勻，說明在提取過程中基本沒有破壞它本身的纖維結(jié)構(gòu)，而PSC的孔徑較多且分布不均勻，說明酶對膠原蛋白的結(jié)構(gòu)有部分改變，但仍較好地保持了其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這一特征與溫慧芳等[5]報道一致。通過對ASC和PSC的SEM圖分析可知，膠原蛋白的提取方式不同，其結(jié)構(gòu)也不盡相同；但這兩種方法所提取的膠原蛋白都保留了較完整的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分析對比了酸法、酶法提取牦牛骨膠原蛋白的理化特性得出以下結(jié)論：采用酸法從牛骨中提取膠原蛋白得率是2.24%，酶法膠原蛋白得率是3.32%，酶法較酸法提取率提高了48.21%，但酶法提取的成本較高；2 種方法提取的膠原蛋白都含有其特征性氨基酸，且Gly含量最多，PSC中氨基酸除Cys、Val、Met外，其他氨基酸含量均高于ASC，故推測PSC的純度可能相對較高；酸法和酶法提取的膠原蛋白的紫外光譜基本一致，在230 nm左右波長處有最大紫外吸收峰，且在280 nm波長處未出現(xiàn)紫外吸收峰，說明牦牛骨ASC和PSC中均不含有Trp，是典型的膠原蛋白；Nagai等[32]研究表明膠原蛋白在水系中纖維的Ts可以反映其穩(wěn)定性，Ts與膠原蛋白中亞氨基的含量呈正相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)測得ASC和PSC的Ts分別為40.12 ℃和40.94 ℃，這可能是由于ASC和PSC的分子特性和構(gòu)型存在差異；紅外光譜及SDS-PAGE顯示提取的膠原蛋白主要由α、β、γ三種亞基組分組成，屬于I型膠原蛋白，且三股螺旋結(jié)構(gòu)完整。ASC的γ鏈和β鏈較淺較細(xì)，α鏈條帶相對淺細(xì)且無70 kDa以下的條帶，可能是因?yàn)锳SC的蛋白結(jié)構(gòu)相對較為完整，含有較少小分子的水解膠原及多肽；牦牛骨ASC和PSC都保留了較為完整的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，兩者呈現(xiàn)出相對統(tǒng)一規(guī)則的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但酸法提取膠原蛋白結(jié)構(gòu)分布相對均勻，推測其孔徑的大小可能與制備過程中含水量有關(guān)。

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