姬成宇，石媛媛，李夢琴,2,*，張 劍,2，安艷霞,2，艾羽函

（1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.農(nóng)業(yè)部大宗糧食加工重點實驗室，河南 鄭州 450002）

隨著面制品行業(yè)的快速發(fā)展，冷凍技術被越來越多的應用到面團生產(chǎn)中，冷凍面團技術得到迅速發(fā)展[1]。但研究發(fā)現(xiàn)，冷凍面團饅頭在凍藏后達不到新鮮饅頭的品質(zhì)[2]，隨著凍藏時間的延長，冷凍面團表面變得粗糙，成品質(zhì)量下降[3]。趙雷[4]發(fā)現(xiàn)當面筋蛋白凍藏時間超過90 d后，面筋網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)幾乎不存在。王沛[5]研究發(fā)現(xiàn)凍藏降低了面筋蛋白與水的結(jié)合作用，隨著凍藏時間的延長，面筋蛋白發(fā)生解聚，從而使得面筋網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)退化。針對這種問題，劉國琴等[6]運用圓二色譜研究凍藏對面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)凍藏90 d后面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)變化最顯著。Ribotta等[7]運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）技術發(fā)現(xiàn)凍藏使得冷凍面團中面筋蛋白的高分子質(zhì)量谷蛋白條帶強度減弱，認為可能是谷蛋白由于冰晶的重結(jié)晶而發(fā)生了解聚行為。

凍藏期間溫度的波動會引起重結(jié)晶，破壞面筋蛋白結(jié)構(gòu)，使冷凍面團品質(zhì)下降[8-9]。冷凍面團在凍藏過程中，隨著凍藏時間的延長，冷凍面團表面水分發(fā)生干耗，內(nèi)部水分緩慢移動到表面，造成面團中水分的喪失[10]，隨著時間的延長，水分減少使得表面產(chǎn)生裂紋，影響冷凍面團品質(zhì)及外觀。溫度波動時，冷凍面團中冰晶不斷出現(xiàn)融化重組，發(fā)生重結(jié)晶，而重結(jié)晶產(chǎn)生的冰晶通常較大，會破壞面筋網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，從而影響冷凍面團及成品品質(zhì)[11-12]。因此，如何改善冷凍面團的品質(zhì)實現(xiàn)傳統(tǒng)面制品的工業(yè)化急需研究。

目前，食品界改善冷凍面團的品質(zhì)和延長貨架期主要依靠添加劑，抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是我國于2006年批準可用于冷凍食品的新型添加劑[13]。國內(nèi)對于AFPs的研究雖然已有不少，但大多集中在面包生產(chǎn)中，將其應用于傳統(tǒng)中式蒸煮冷凍面制品的研究相對較少。杜浩冉等[14-15]利用響應面法分別優(yōu)化了冷凍面團饅頭的工藝配方和混合發(fā)酵劑制作冷凍面團饅頭的復配添加劑配方。Daniel等[16]將AFPs添加到冷凍甜食中，結(jié)果表明冷凍甜品的品質(zhì)得到顯著改善。Payne等[17]研究發(fā)現(xiàn)將牛肉浸泡在APFs溶液中，在-20 ℃凍結(jié)之后，冰晶體積明顯縮小。Zhang Chao等[18]研究了AFPs對冷凍面團質(zhì)地特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加AFPs可維持面包體積和改善面團的柔軟性，降低硬度，這主要是因為結(jié)冰水含量的降低。

本研究旨在探討凍藏和凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團蛋白質(zhì)特性、水分狀態(tài)等的影響，揭示AFPs在冷凍面團凍藏和溫度波動條件下穩(wěn)定冷凍面團品質(zhì)的作用效果和內(nèi)在機理。為AFPs提高傳統(tǒng)中式蒸煮冷凍面團產(chǎn)品質(zhì)量提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高筋小麥粉 鄭州金苑面粉廠；高活性干酵母安琪酵母股份有限公司；AFPs 鄭州奇華頓化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設備

B5A型多功能攪拌機 廣州威萬事實業(yè)有限公司；FX-15S面包發(fā)酵箱 廣州市賽思達機械設備有限公司；HDGDJ-150高低溫交變試驗箱 上海衡鼎儀器設備廠；LGJ-10D冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；UV-2000紫外-可見分光光度計、凝膠成像系統(tǒng) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；Spectrum GX傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Perkin Elmer公司；PQ001 MicroMR柜式核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成像儀上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍面團及冷凍面團饅頭的制備

將100 g面粉與0.5 g AFPs混合均勻（不含AFPs的為空白面團）；將混合的面粉倒入和面機，加入1 g預活化的酵母、50 g水進行和面至無生粉夾雜。取出靜置10 min，將靜置好的面團用壓面機壓面5 次（5 mm），然后分割成30 g的面團，整形后放入溫度35 ℃、相對濕度85%的醒發(fā)箱中發(fā)酵20 min。待面團溫度下降后放入-40 ℃低溫試驗箱中速凍30 min，取出放入-18 ℃冰箱中凍藏。

制備冷凍面團饅頭時，將冷凍面團置于溫度35 ℃、相對濕度85%的醒發(fā)箱中解凍發(fā)酵30 min。

1.3.2 冷凍面團凍藏凍融的處理

將制備好的冷凍面團于-18 ℃條件下分別凍藏1、7、15、30、60、90 d，取出處理，得到不同凍藏時間的樣品，待測。

凍融循環(huán)處理參照葉曉楓等[19]的方法略作修改，將凍藏3 d的冷凍面團取出，在35 ℃恒溫箱中解凍30 min，取出部分面團進行處理，記作第0次凍融循環(huán)；其余面團放入-18 ℃冰箱中凍藏1 d后取出，按上次解凍條件解凍，取出部分面團進行處理，記作第1次凍融循環(huán)；其余部分按上述方法分別進行第2、3、4、5次凍融循環(huán)。

樣品經(jīng)凍藏凍融處理后，取出部分進行冷凍干燥，粉碎，過120 目篩，裝入自封袋中備用。

1.3.3 冷凍面團游離巰基和二硫鍵含量的測定

稱取75 mg粉碎過篩的冷凍面團樣品，采用Ellman’s試劑比色法測定冷凍面團二硫鍵及游離巰基的含量[20]。

1.3.4 冷凍面團的SDS-PAGE測定

參考王晶[21]的方法進行單向SDS-PAGE分析冷凍面團中高分子質(zhì)量谷蛋白亞基（high molecular weight-glutenin subunits，HMW-GS）和低分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基（low molecular weight-glutenin subunits，LMW-GS）的組成。

1.3.5 冷凍面團蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的FTIR測定

稱取一定量的樣品，與溴化鉀質(zhì)量比為1∶100在瑪瑙研缽中研磨并混合均勻，壓制成薄片，用FTIR儀對樣品做全波段（400～4 000 cm-1）掃描測定，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1。之后使用OMNIC 8.0數(shù)據(jù)處理軟自動校正水汽，運用Peakf i t 4.12軟件截取1 600～1 700 cm-1波段，并進行基線校正，高斯去卷積，二階導數(shù)擬合，使殘差大于0.96，指認蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)特征峰并計算各結(jié)構(gòu)含量。

1.3.6 冷凍面團失水率的測定

將速凍好的冷凍面團饅頭每組取出3 個，用保鮮膜包好，置于-18 ℃冰箱中凍藏，經(jīng)凍藏凍融處理后按下式計算面團失水率：

式中：m1為樣品凍藏前面團質(zhì)量/g；m2為樣品凍藏后面團質(zhì)量/g。

1.3.7 冷凍面團NMR弛豫時間的測定

利用FID試驗調(diào)節(jié)共振中心頻率，利用CPMG脈沖序列測量樣品的自旋-自旋弛豫時間（T2）。稱取面團（1.00±0.01）g放入試管中，置于永久磁場中心位置射頻線圈的中心，進行CPMG脈沖序列的掃描實驗。CPMG實驗參數(shù)：采樣點數(shù)104 902，重復掃描次數(shù)8，重復時間2 000 ms，半回波時間210 μs。利用T2反演擬合軟件對CPMG弛豫衰減曲線進行反演得到弛豫圖譜和T2值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行均值的多重比較（Duncan法），簡單的分析和作圖用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍藏期AFPs對冷凍面團游離巰基和二硫鍵含量的影響

圖1 凍藏條件下AFPs對冷凍面團游離巰基和二硫鍵含量的影響Fig.1 Effect of AFPs on the contents of –SH and –S–S– of frozen dough during frozen storage

由圖1可見，隨著凍藏時間的延長，預發(fā)酵冷凍面團中游離巰基含量均上升，二硫鍵含量逐漸減少。由此可見，冷凍面團中的二硫鍵隨著凍藏時間的延長發(fā)生斷裂，與Zhao Lei等[22]研究結(jié)論一致。相比較于空白面團，添加了AFPs冷凍面團的二硫鍵和巰基含量變化幅度較小，說明AFPs可以在凍藏過程中減少面團中二硫鍵的斷裂，能較好地保護面筋蛋白的功能特性。

2.2 凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團游離巰基和二硫鍵含量的影響

圖2 凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團游離巰基和二硫鍵含量變化Fig.2 Effect of AFPs on the contents of –SH and –S–S– of frozen dough during freeze-thaw treatment

由圖2可見，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，冷凍面團中游離巰基含量上升，在凍融循環(huán)5 次后，添加AFPs冷凍面團游離巰基含量比空白面團有所降低；相反地，冷凍面團中二硫鍵含量降低，在凍融循環(huán)5 次后，比空白面團二硫鍵含量有所增多，說明AFPs的加入降低了預發(fā)酵冷凍面團中二硫鍵的斷裂。

比較圖1和2可知，凍融循環(huán)過程中預發(fā)酵冷凍面團中游離巰基和二硫鍵變化趨勢與凍藏過程相同，但變化幅度均高于凍藏過程，說明凍融處理對冷凍面團中二硫鍵的破壞更明顯。這可能是因為凍融循環(huán)使冷凍面團中冰晶反復重結(jié)晶加劇了對面團面筋結(jié)構(gòu)的破壞。而AFPs對于冰晶的修飾作用和重結(jié)晶的抑制作用可以有效地抑制凍融過程中面筋結(jié)構(gòu)的破壞程度[23]，減少二硫鍵的斷裂。

2.3 AFPs對冷凍面團SDS-PAGE的影響

由圖3、4可知，凍藏和凍融循環(huán)處理下，100 kDa上下有3 條清晰的條帶，表示這部分的亞基分子質(zhì)量最大，遷移率最慢，顏色較淺，屬于HWM-GS；30～70 kDa之間的圖譜顏色較深，含量較高，在凝膠上遷移速率較快，分子質(zhì)量較小，屬于LMW-GS和醇溶蛋白。觀察凍藏和凍融循環(huán)SDS-PAGE圖發(fā)現(xiàn)條帶數(shù)目、相對遷移率等均無明顯的變化，這說明凍藏和凍融循環(huán)對于冷凍面團蛋白質(zhì)的亞基無明顯影響，且添加AFPs對冷凍面團亞基無影響。

圖3 凍藏條件下冷凍面團SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE prof i les of frozen dough during frozen storage

圖4 凍融循環(huán)條件下冷凍面團SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE prof i les of frozen dough during freeze-thaw treatment

2.4 凍藏條件下AFPs對冷凍面團蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響

FTIR酰胺I帶各個波峰二級結(jié)構(gòu)指認參照馮蕾等[24]方法。凍藏期間AFPs對冷凍面團蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響見圖5。

將2 種冷凍面團的FTIR圖運用Peakf i t軟件進行基線校正，高斯去卷積后進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)表征峰的擬合，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指認的特征峰的峰面積發(fā)生變化，對應二級結(jié)構(gòu)的含量也隨著變化。由圖5可知，經(jīng)過90 d凍藏后，1 617 cm-1處的分子間β-折疊的含量隨凍藏時間的延長呈上升趨勢，1 669 cm-1處的β-轉(zhuǎn)角含量呈下降趨勢，而反向平行β-折疊、α-螺旋、無規(guī)則卷曲和1 683 cm-1處的β-折疊這4 種二級結(jié)構(gòu)的含量在凍藏過程中有小幅度波動，但變化不明顯。說明凍藏會影響面團蛋白質(zhì)的分子間β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量，而隨著β-轉(zhuǎn)角的減少，分子間β-折疊增加，可能是β-轉(zhuǎn)角在凍藏過程中轉(zhuǎn)化為了β-折疊，與趙雷[4]研究結(jié)果一致。從圖5還可看出，添加AFPs面團中的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化較空白面團低，表明AFPs的加入能夠保護面團中蛋白質(zhì)分子間的氫鍵作用，且保護β-轉(zhuǎn)角不受冰晶的破壞。

圖5 凍藏條件下冷凍面團FTIR圖Fig.5 FTIR spectra of frozen dough during frozen storage

2.5 凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響

圖6 凍融循環(huán)條件下冷凍面團FTIR圖Fig.6 FTIR spectra of frozen dough during freeze-thaw treatment

由圖6可知，凍融循環(huán)過程中2 種面團的β-折疊含量均呈上升趨勢，β-轉(zhuǎn)角含量呈下降趨勢，這與冷凍面團在凍藏條件下二級結(jié)構(gòu)變化趨勢一樣，但凍融循環(huán)條件下2 種二級結(jié)構(gòu)的變化幅度明顯大于凍藏過程，AFPs冷凍面團β-折疊降低幅度較空白組小。與凍藏過程不同的是，凍融循環(huán)過程中α-螺旋含量呈下降趨勢。凍融過程由于溫度的不斷波動及外界壓力的變化，導致水分遷移及重結(jié)晶，大冰晶數(shù)量增多，對蛋白質(zhì)中的氫鍵起到破壞作用，使得蛋白質(zhì)的親水和疏水殘基暴露出來，蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)出現(xiàn)新的分子交聯(lián)，從而改變了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。李學紅等[25]研究有同樣的結(jié)論。而AFPs的加入能夠增大面筋蛋白的分子內(nèi)氫鍵作用，同時通過促使被破壞的分子間氫鍵的再次形成使面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定狀態(tài)。

2.6 凍藏期間AFPs對冷凍面團失水率的影響

圖7 凍藏條件下AFPs對冷凍面團失水率的影響Fig.7 Effect of AFPs on water loss of frozen dough during frozen storage

由圖7可知，預發(fā)酵冷凍面團隨著凍藏時間的延長失水率顯著提高，凍藏15 d后，空白組失水率顯著增加。這是因為冷凍面團在凍藏時，凍藏室與面團之間的蒸汽壓差，以及冷凍面團表面水分不斷以冰晶升華方式減少，使得冷凍面團內(nèi)部水分不斷向外遷移[26]，冷凍面團中的水分持續(xù)減少。對比可知，AFPs冷凍面團失水率升高趨勢明顯緩于空白組，說明在凍藏過程中，AFPs可以提高面團的持水力，有效地減少冷凍面團水分的減少，說明AFPs在一定程度上可以減少面團中可凍結(jié)水的含量，從而抑制水分的散失[27]。

2.7 凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團失水率的影響

圖8 凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團失水率的影響Fig.8 Effect of AFPs on water loss of frozen dough during freeze-thaw treatment

由圖8可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，預發(fā)酵冷凍面團的失水率顯著提高。這是因為在凍融循過程中，加速了面團中水分的遷移及重結(jié)晶，使得冰晶逐漸增大[28-29]，大冰晶進一步破壞了面團的面筋網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，降低面團持水能力。多次凍融處理后，AFPs冷凍面團失水率均低于空白組，說明AFPs的加入能夠減緩凍融循環(huán)中冷凍面團水分的流失，可能是由于AFPs能夠抑制面團中冰晶的重結(jié)晶現(xiàn)象，降低大冰晶的產(chǎn)生，維持面團的持水能力，從而降低面團水分流失的速率。

2.8 凍藏條件下AFPs對冷凍面團水分分布狀態(tài)的影響

采用NMR技術測定冷凍面團中水分分布狀態(tài)，運用CPMG序列測定凍藏條件下AFPs對冷凍面團體系中自旋-自旋弛豫時間T2變化影響。由表1可知，在弛豫圖譜上有2 個擬合峰，其中第1個峰T21在1～3 ms之間，表征的是與蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)緊密結(jié)合的水分，這部分水的流動性最弱，稱為結(jié)合水；第2個峰T22在8～13 ms之間，這部分通常被認為是直接與強結(jié)合水以氫鍵結(jié)合、間接與大分子結(jié)合的弱結(jié)水層，相比T21流動性更大，為半結(jié)合水[30]，說明面團中水分主要以結(jié)合水和半結(jié)合水狀態(tài)存在，A21、A22表示對應類型氫質(zhì)子密度，質(zhì)子密度越大，說明該類型水分含量越高。但在冷凍面團凍藏30 d后，圖譜中的峰1和峰2部分重疊，說明在此橫向弛豫時間區(qū)間內(nèi)，冷凍面團中的1H的運動呈連續(xù)地變化[31]。

表1 凍藏條件下AFPs對冷凍面團弛豫時間T2變化Table1 Effect of AFPs on the changes in T2 of frozen dough during frozen storage

由表1可知，冷凍面團T2值隨著凍藏時間的延長逐漸增大，水分流動性增強，說明凍藏過程加速了冷凍面團中水分的移動。在凍藏30 d后，橫向弛豫時間明顯增大（P＜0.05），其中結(jié)合水含量下降，半結(jié)合水含量升高，凍藏60 d后，結(jié)合水與半結(jié)合水峰幾乎重合，半結(jié)合水含量明顯增加。這是由于凍藏過程中產(chǎn)生的冰晶破壞面團面筋網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，造成面團持水能力降低，水分流動性增強。AFPs冷凍面團與空白組變化趨勢相同，與空白組相比，添加AFPs的豫馳時間T2值有所下降，凍藏60 d后還能檢測到結(jié)合水峰，說明AFPs可以有效抑制面團中水分的遷移，提高冷凍面團在凍藏期間的穩(wěn)定性。

2.9 凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團水分分布狀態(tài)的影響

表2 凍融循環(huán)條件下AFPs對冷凍面團弛豫時間T2變化Table2 Effect of AFPs on the changes in T2 of frozen dough during freeze-thaw treatment

由表2可知，凍融循環(huán)3 次后，兩組冷凍面團T21和T22的峰位置基本沒有發(fā)生變化，凍融循環(huán)4 次后，空白組T22值明顯增大，面團中水分流動性顯著提高，添加AFPs后，T22值基本不變，表明AFPs能夠減弱凍融循環(huán)對冷凍面團水分流動性的影響。

此外，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，冷凍面團中結(jié)合水含量逐漸減少，半結(jié)合水含量顯著增加（P＜0.05），表明凍融循環(huán)過程中面團中結(jié)合水含量下降、半結(jié)合水含量上升，半結(jié)合水在表面不斷生長和重結(jié)晶，大冰晶的增多及對面團產(chǎn)生的機械力導致面團持水力下降，水分散失。而與空白組相比，添加AFPs后，面團結(jié)合水和半結(jié)合水含量變化較空白組小，這說明AFPs可以降低凍融循環(huán)過程中面團水分的流動性，減少水分的遷移。

3 結(jié) 論

經(jīng)凍藏和凍融循環(huán)后，冷凍面團中游離巰基含量上升，二硫鍵含量下降。隨著凍藏時間的延長，二級結(jié)構(gòu)中分子間β-折疊含量增大，β-轉(zhuǎn)角含量減小，凍融循環(huán)還會使得α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，添加AFPs組的冷凍面團蛋白質(zhì)特性變化均小于無添加組，因此，在凍藏和凍融循環(huán)過程中，AFPs能夠抑制二硫鍵的斷裂和二級結(jié)構(gòu)的變化；SDS-PAGE圖譜顯示，凍藏和凍融循環(huán)對于冷凍面團蛋白質(zhì)的亞基無明顯影響，且添加AFPs對冷凍面團亞基無影響。

經(jīng)凍藏和凍融循環(huán)后，冷凍面團的失水率明顯升高，馳豫時間T21和T22值變大，結(jié)合水含量減少，半結(jié)合水增多，表明凍藏和凍融過程增強了面團水分的流動性，導致面團持水性降低，體系中的水分子從結(jié)合態(tài)向半結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變。添加AFPs后冷凍面團失水現(xiàn)象有所改善，凍藏期T21和T22值有所減小，凍融循環(huán)下T21和T22值基本不變，結(jié)合水含量上升，降低了凍融過程中面團水分的流動性，有效地提高了面團的持水能力，AFPs能夠改善凍藏和凍融過程中冷凍面團饅頭的品質(zhì)。

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