郭興峰，趙文婷，廖小軍，胡小松，王 曉，吳繼紅,*

（1.聊城大學農學院，山東 聊城 252000；2.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，北京 100083；3.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014）

隨著人們生活節(jié)奏的持續(xù)加快和食品工業(yè)化水平的不斷提高，包裝類食品已經成為人們生活中不可缺少的食品種類，在包裝類食品的加工過程中熱處理是必不可少的加工工序。傳統(tǒng)的食品加工過程中，熱處理過程的作用通常包括：食品加工工藝和產品自身特性的需要，如真空濃縮、熱風干燥等；食品包裝過程中進行的殺菌工藝，如巴氏殺菌、超高溫殺菌等；保持食品的感官特性的需要，如進行食品滅酶處理等。即使在現在新興的非熱加工過程中，食品原料往往也需要進行水浴或蒸汽加熱，以達到食品滅酶的目的，保持食品在貯藏過程中感官品質[1-4]。加熱工藝除了以上正面作用外，在食品加工中還不可避免會對食品的顏色、質構和營養(yǎng)等造成負面的影響[5-7]。張甫生等[5]研究超高壓和加熱對黃桃罐頭質地、黏度和細胞結構等的影響時發(fā)現加熱處理會使黃桃罐頭的果肉質地軟化、顯微結構破壞及可溶性固形物增加，嚴重影響產品品質。Zhao Liang等[6]研究超高壓和巴斯殺菌對黃瓜汁的品質影響時發(fā)現，經過巴斯殺菌的黃瓜果汁的品質顯著比超高壓處理果汁的品質要差。Ans等[7]研究不同溫度條件下超高壓處理胡蘿卜對其質構的影響，結果表明加熱處理使胡蘿卜的質構嚴重軟化，且在不同的溶液環(huán)境中胡蘿卜的軟化規(guī)律不盡相同，在有Ca2+存在的情況下胡蘿卜的質構變化相比于水溶液中減緩。

果膠作為一類廣泛存在于植物細胞內的寡糖和多聚糖的混合物，由于具有增稠、穩(wěn)定、乳化等作用而作為天然、綠色的食品添加劑廣泛應用于各類果醬、果凍、飲料和軟糖等食品的加工過程中。食品加工時，不同加工條件包括加熱溫度、pH值、酶、微波等均會對果膠結構和性質產生重要的影響，甚至引起果膠分子鏈的降解[8-10]。Fishman等[8]研究了加壓條件下微波輔助提取對柑橘囊衣果膠理化性質的影響，結果表明隨著超聲處理時間的延長會引起果膠的平均分子質量、回旋半徑、固有黏度等理化指標改變。Fraeye等[9]研究表明80～110 ℃不同pH值條件下果膠會發(fā)生不同程度的水解反應和β-消除反應，從而引起果膠分子的降解。Chen Jun等[10]研究動態(tài)高壓微射流技術后果膠的表觀黏度、平均分子質量、果膠的粒徑分布等理化指標均明顯下降，同時電鏡觀察表明果膠由完整的片狀結構轉變?yōu)槎嗫椎乃槠Y構。富含果膠的酸性飲料大都pH值在4.3以下，探索酸性條件下食品熱加工過程對果膠流變和結構特性的影響及規(guī)律對探究在酸性條件下熱處理對產品的理化和感官特性的影響及規(guī)律十分重要。

本實驗通過高靜壓技術以柚皮為原料制備高分子質量果膠，并對酸性條件下高分子質量果膠溶液進行加熱處理，研究該條件下熱處理對果膠表觀黏度和流變特性的影響，并通過測定半乳糖醛酸含量、酯化度和分子質量分布等果膠理化指標，結合原子力顯微鏡掃描果膠分子結構狀態(tài)的變化，揭示酸性條件下熱處理對果膠流變和結構特性的影響規(guī)律及機制，為富含果膠的酸性食品在熱加工過程中的品質變化提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮、無病蟲害、成熟的琯溪蜜柚（Citrus grandis Osbeck），購于北京市海淀區(qū)明光寺農副產品綜合批發(fā)市場。將蜜柚經剝皮去除果肉后得到柚皮并用清水洗凈，然后柚皮切丁（2 cm×2 cm），于100 ℃蒸汽滅酶2 min后，放入-18 ℃冰箱中預冷，用冷凍真空干燥（隔板溫度18 ℃）至含水量為7%左右，粉碎過60 目篩，真空包裝后4 ℃冷藏備用。

鹽酸、四硼酸鈉、濃硫酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇、無水乙醇（均為分析純） 北京化學試劑公司；半乳糖醛酸、間苯基苯酚（均為分析純） Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

HHP-700-7型高靜壓設備 包頭科發(fā)高壓科技有限責任公司；AY120型萬分之一分析天平 日本島津公司；EY-300A型分析天平 日本松下電器公司；HH-601型超級恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司；MF-400型單室真空封口機 廣州鴻億機電設備制造有限公司；CR21GIII型高速冷凍離心機 日本日立公司；LGJ-25C型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；HY-04A型小型高速粉碎機 北京環(huán)亞天元有限公司；FMP-3D-BIO型原子力顯微鏡 美國Asylum Research儀器公司；AR550旋轉流變分析儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 高分子質量果膠的制備

參考Guo Xingfeng等[11]的方法，將10 g柚皮干粉裝于1 000 mL的聚乙烯塑料袋中，加入預熱至85 ℃的pH值為1.5的提取液500 mL，用單室真空封口機進行封口，保溫5 min后立刻放入預熱好的聚四氟乙烯保溫桶中進行超高壓處理。超高壓處理參數分別設定為：提取壓力500 MPa，保壓時間10 min，壓力波動范圍±10 MPa，泄壓時間2 s。卸壓后立即離心（10 000 r/min，10 min，18 ℃）得到上清液，轉移至燒杯中冷卻后，加入2 倍體積95%乙醇溶液沉淀過夜以使果膠充分析出[12]，用400 目濾布過濾分離出果膠沉淀，用力將果膠中吸附的水分擠壓干凈，并用30 mL乙醇清洗2 次，每次5 min以除去色素和游離的中性糖[13]，最后用冷凍真空干燥機對所得果膠進行干燥24 h，得到干燥的果膠樣品，放入干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 果膠的熱處理

稱取9.0 g果膠置于2 275 mL pH 3.7的鹽酸溶液中，用保鮮膜封口后置于磁力攪拌器上攪拌至完全溶解，得到質量分數為0.4%的果膠溶液。將溶解好的果膠溶液裝入容積為400 mL的聚乙烯塑料袋中，每袋裝入的果膠溶液體積為150 mL，用真空封口機密封后，放入溫度為85 ℃的恒溫水浴中保溫，保溫時間分別為20、40、60、80、100 min，取出后立即放入冰水中冷卻并轉移至燒杯中，分別加入2 倍體積95%乙醇溶液沉淀過夜以使果膠充分析出，用400 目濾布過濾，并用30 mL乙醇清洗2 次，以除去色素和游離的中性糖，最后用冷凍真空干燥對所得果膠進行干燥24 h，得到干燥的果膠樣品，放入干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 表觀黏度測定

參考Guo Xingfeng等[14]的方法使用旋轉流變分析儀進行，實驗選用的夾具為錐頭式同心圓筒（定子半徑15.00 mm、轉子半徑14.00 mm、浸沒高度42.00 mm、間隙5 920 μm），選擇的測定程序為穩(wěn)態(tài)剪切峰值保持模式，溫度為25 ℃，剪切速率為10 s-1，測定時間為1 min，采樣間隔時間為10 s。測定時使樣品剛剛沒過轉子，采用恒溫循環(huán)水系統(tǒng)進行溫度控制。

1.3.4 果膠流變特性測定

參考Guo Xingfeng等[11]的方法使用旋轉流變分析儀進行，實驗選用夾具為錐頭式同心圓筒（定子半徑15.00 mm、轉子半徑14.00 mm、浸沒高度42.00 mm、間隙5 920 μm），選擇的測定程序為穩(wěn)態(tài)剪切模式，溫度為25 ℃，剪切速率為0.01～100 s-1，變量掃描為對數模式，采樣周期10 s，容差百分比為5.0%。測定時使樣品剛剛沒過轉子，采用恒溫循環(huán)水系統(tǒng)進行溫度控制。

應用冪律模型對果膠熱處理前后果膠的表觀黏度隨著剪切速率的變化進行擬合，冪律方程如式（1）所示：

式中：τ為剪切應力/Pa；k為稠度系數/（Pa·sn）；γ為剪切速率/s-1；n為流變特性指數；其中，n等于1時為牛頓流體行為，n小于1時為假塑性流體（剪切變稀），n大于1時為脹塑性流體（剪切稠化）。

1.3.5 半乳糖醛酸含量的測定

參考Blumenkrantz等[15]描述的方法，并略有改變。

1.3.5.1 標準曲線繪制

取20 mL具塞試管6 支放入冰水浴中，分別量取質量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL半乳糖醛酸標準溶液1 mL，再加入6 mL 12.5 mmol/L的濃硫酸-四硼酸鈉溶液，充分振蕩置于沸水浴中加熱5 min，并再次放入冰水浴中冷卻。冷卻后分別向各試管中加入0.1 mL的0.15%間苯基苯酚溶液并輕輕振蕩，放置15 min后用分光光度計測定波長520 nm處其吸光度，繪制標準曲線回歸后得到標準曲線方程：y=77.45x+1.786，R2=0.999。

1.3.5.2 樣品中半乳糖醛酸含量測定

精確稱取果膠樣品0.1 g，溶于100 mL去離子水中，待完全溶解后再用去離子水稀釋至80 μg/mL，然后取果膠溶液1 mL，加入6 mL 0.012 5 mol/L的濃硫酸-四硼酸鈉溶液，立即放入冰水浴中。振蕩混合均勻后于沸水浴中5 min，并再次放入冰水浴中冷卻至室溫后加入0.1 mL的0.15%間苯基苯酚溶液振蕩，放置15 min后用分光光度計測定其在波長520 nm處吸光度，空白加入的反應試劑為0.5%氫氧化鈉溶液代替果膠溶液。按公式（2）計算果膠中半乳糖醛酸百分比。

式中：a為從標準曲線中查得的半乳糖醛酸質量濃度/（μg/mL）；80為樣品質量濃度/（μg/mL）。

1.3.6 果膠酯化度測定

參考QB 2484—2000《食品添加劑 果膠》的方法，并略有改變。量取20 mL質量分數為0.5%的果膠溶液并加入80 mL去CO2水，用0.05 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至pH 8.1，記錄所消耗氫氧化鈉的體積（V1）即為原始滴定度。繼續(xù)加入20 mL、0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，加塞后強烈振搖15 min，加入能夠完全中和20 mL氫氧化鈉溶液的鹽酸溶液（20.50 mL），振搖至粉紅色消失為止。用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液再次滴定至pH 8.1，記錄所消耗氫氧化鈉的體積（V2），即為皂化滴定度。

果膠酯化度按公式（3）計算：

1.3.7 果膠分子質量分布的測定

參考Fishman等[16]的方法采用體積排阻色譜法測定果膠分子質量。將0.2%果膠溶液和標準品經過0.45 μm的微孔濾膜后進行色譜分析。以分子質量5.9、11.8、22.8、47.3、112、212、404、788 kDa的葡聚糖標準品制作標準曲線。

檢測條件為：德國Knauer高效液相系統(tǒng)，K-1001泵，RI-2301示差檢測器，20 μL進樣環(huán)，流動相為0.05 mol/L NaNO3，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，Shodex OHpak SB-804 HQ色譜柱（8.0 mm×300 mm），保護柱為Shodex OHpak SB-G，檢測器為示差檢測器，進樣量20 μL。根據不同葡聚糖標品在體積排阻色譜圖上保留時間與其對應分子質量的對數（lgmp）作圖，并回歸得到葡聚糖標品分子質量和峰位保留時間的線性方程：y=-0.291x+9.195，R2=0.992。

1.3.8 果膠微觀形態(tài)分析

參考Zhang Lifeng等[17]采用原子力顯微鏡進行測定，將20 μL質量濃度為10 μg/mL的果膠溶液滴于新鮮平整的云母片表面，放置2 min，用適量雙蒸水將未吸附的果膠分子沖走，然后用氮氣吹掃，將云母片表面的水分迅速吹干，使云母片快速干透，然后將載有果膠分子的云母片置于原子力顯微鏡的檢測槽中進行檢測。原子力顯微鏡的掃描模式為非接觸輕敲模式，所使用探針為硅探針：PPP-NCHR Silicon SPM Sensor，共振頻率為330 kHz，力常數為42 N，分辨率為512×512，掃描尺寸為2 μm×2 μm，掃描速度為1 Hz。掃描圖像應用原子力顯微鏡的離線數據處理軟件進行分析。

1.4 數據分析

所有實驗均進行3 次重復，數據處理采用SPSS 16.0和OriginPro 8.0軟件。不同處理間的數據采用多重比較方法，顯著水平為0.05，并用標記字母法進行標記，流變特性由儀器自帶的分析軟件（Rheology Advantage Data Analysis）進行數據處理并應用Origin 8.0數據分析軟件進行曲線擬合。

2 結果與分析

2.1 熱處理對果膠表觀黏度的影響

圖1 pH 3.7時加熱對果膠表觀黏度的影響Fig.1 Effect of heating at pH 3.7 on the apparent viscosity of pectin

如圖1所示，果膠的表觀黏度隨著熱處理時間的延長而發(fā)生顯著性降低。當85 ℃熱處理40 min后果膠溶液的表觀黏度即可減小1 倍左右，原因可能是果膠分子發(fā)生了降解或果膠分子立體結構發(fā)生了改變。果膠作為高酸性果蔬汁、果蔬飲料、酸奶等休閑食品中常用的增稠劑、穩(wěn)定劑或乳化劑，能夠對產品的品質保持起到重要作用，表觀黏度的下降將降低果膠的穩(wěn)定效果[18]。Buggenhout等[19]比較了加熱和超高壓處理對番茄醬流動特性的影響，發(fā)現40 ℃加熱15 min會顯著增大番茄醬的流動性，顯著降低番茄醬的表觀黏度。

2.2 熱處理對果膠流變特性的影響

流變特性與食品的化學成分、分子構造、分子內及分子間結合的狀態(tài)、組織構造之間有很強的相關性[20-22]。如圖2所示，沒有經過加熱處理的果膠溶液表現出最為明顯的非牛頓流體特性，隨著剪切速率的增大表觀黏度顯著減小。而隨著熱處理時間的延長，果膠溶液在各剪切速率條件下的表觀黏度均表現出降低趨勢，在熱處理時間為100 min時果膠的剪切變稀現象最為明顯。如表1所示，所有結果均具有較好的擬合度，而且隨著熱處理時間的延長果膠的流變特性指數顯著增大，而稠度系數則顯著減小，說明隨著熱處理時間的延長果膠在特定剪切速率條件下的黏度越來越小，而其剪切變稀的程度越來越不明顯。

圖2 pH 3.7時加熱對果膠流變特性的影響Fig.2 Effect of heating at pH 3.7 on the rheological behavior of pectin

表1 pH 3.7時加熱對流變特性的影響Table1 Effect of heating at pH 3.7 on the rheological behavior of pectin

2.3 熱處理對果膠半乳糖醛酸含量的影響

圖3 pH 3.7時水浴加熱對果膠半乳糖醛酸百分比的影響Fig.3 Effect of heating at pH 3.7 on the galacturonic acid content of pectin

如圖3所示，85 ℃條件下對果膠溶液熱處理0～100 min均沒有對果膠的半乳糖醛酸的含量產生顯著性的影響。該結果說明在熱處理的過程中沒有發(fā)生中性糖組分和半乳糖醛酸分子的丟失。

2.4 熱處理對果膠酯化度的影響

果膠酯化度是果膠中以酰胺化或甲酯化狀態(tài)存在的羧基數目占全部羧基（游離狀態(tài)、成鹽狀態(tài)、甲酯化狀態(tài)、酰胺化狀態(tài)）總數目的百分比[23-24]。通過研究果膠酯化度的差別可以看出果膠中半乳糖醛酸羧基的酰胺化或甲酯化程度的不同。由圖4所示，在該條件下果膠溶液熱處理后所得果膠的酯化度均在79.28%～82.37%之間，且沒有顯著性區(qū)別。

圖4 pH 3.7時水浴加熱對果膠酯化度的影響Fig.4 Effect of heating at pH 3.7 on the DE of pectin

2.5 熱處理對果膠分子質量分布的影響

果膠分子質量分布為評價果膠理化性質和分子結構的重要指標[25]。如圖5所示，根據高效凝膠色譜測定分子質量的原理，保留時間越小說明分子質量越大，反之亦然?？梢钥闯鲈趐H 3.7、85 ℃水浴條件下加熱不同時間后，果膠分子質量分布曲線基本重合，沒有顯著性的差別。此結果說明在pH 3.7條件下果膠的分子鏈沒有發(fā)生顯著的降解反應。

圖5 pH 3.7時加熱對果膠分子質量分布的影響Fig.5 Effect of heating at pH 3.7 on the molecular mass distribution of pectin

2.6 熱處理對果膠微觀結構的影響

原子力顯微鏡作為一種通過檢測待測樣品表面和原子力探針之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質的表面結構及性質的分析裝備，現在被廣泛應用于材料科學、生命科學、食品科學、環(huán)境科學和醫(yī)學等領域[26-27]。近年來眾多學者也將原子力顯微鏡應用于研究果膠的分子形態(tài)和分子間的聚集狀態(tài)[28-30]。由圖6果膠的原子力顯微鏡的高度圖像和右側的顏色標尺條可以看出各果膠在掃描面積為2.0 μm×2.0 μm的范圍內分子鏈的長短形態(tài)和高度，由圖6a可以看出，果膠多呈現分散和舒展的狀態(tài)，由圖6b～f可以看出，同樣濃度的果膠在pH 3.7條件下分別經過20、40、60、80、100 min熱處理后與圖6a相比，果膠的分子聚集狀態(tài)更加明顯，果膠形態(tài)表現出更多形態(tài)稍大的聚集體。

圖6 pH 3.7時加熱對果膠微觀結構的影響Fig.6 Effect of heating at pH 3.7 on the microstructure of pectin

3 結 論

通過系統(tǒng)研究酸性條件下熱處理對果膠的表觀黏度、流變特性、半乳糖醛酸含量、酯化度、分子質量分布和微觀形態(tài)結構的影響，深入探討熱處理對果膠流變和結構特性的影響，提出酸性條件下熱處理導致果膠黏度減小和流變特性改變的機制，得出以下結論：在pH 3.7條件下，果膠溶液在85 ℃熱處理0～100 min會導致果膠表觀黏度和稠度系數降低，同時引起果膠流變特性指數的增大，致使果膠的增稠效果減弱。但果膠的半乳糖醛酸含量、酯化度和分子質量分布均沒有顯著性變化。通過對果膠微觀結構的研究發(fā)現，果膠的分子鏈內和分子鏈之間會發(fā)生聚集現象，引起果膠空間立體結構的減小，進而導致果膠表觀黏度的減小。該研究結果為富含果膠的酸性食品在熱加工過程中的品質變化提供了理論依據和指導。

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