焦鵬濤，范文輝，孫業(yè)平，劉文軍,3，李晶,3

1 中國科學院微生物研究所 病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101

2 廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530004

3 中國科學院大學，北京 100049

流感病毒 (Influenza virus) 可引起人和其他動物季節(jié)性或大流行性流感的發(fā)生，根據(jù)其核蛋白 (NP) 和基質蛋白 (M1) 抗原性不同，可以分為A、B、C、D四個型[1-2]。其中，A型流感病毒(IAV) 流行廣泛，可感染人和多種動物[3]，是引發(fā)人類及畜禽流感的主要類型。B型流感病毒(IBV) 宿主特異性較強，目前報道主要感染人和海豹[4-5]。C型流感病毒主要感染人和豬，D型流感病毒主要感染豬和牛[6]。其中，IBV是Francis等在1940年首次從患病兒童體內分離獲得，隨后在 1971年，Chang等報道從犬中也分離得到了IBV，2000年荷蘭科學家Osterhaus等又從海豹中成功分離[4]。在長期的進化中，根據(jù)病毒HA片段核苷酸序列差異，IBV主要分為兩大譜系，即以B/Victoria/2/87毒株為代表的 B-Victoria分支和B/Yamagata/16/88毒株為代表的B-Yamagata分支。

流感幾乎每年都會暴發(fā)，給人群造成了不同程度的呼吸系統(tǒng)疾病，對全球公共衛(wèi)生造成了嚴重的威脅。大流行性流感主要由IAV引發(fā)，但IBV引發(fā)的季節(jié)性流感同樣不容忽視。70多年來，IBV曾引起16次流感局部暴發(fā)和流行，感染后發(fā)病率和死亡率較高，多發(fā)于兒童及青少年[7-8]，研究人員對美國1976–1999年流感相關死亡的調查分析發(fā)現(xiàn)，IBV引起的死亡率僅低于IAV的H3N2亞型，高于 IAV的 H1N1亞型[9]，另外對美國1997–2009年間流感相關死亡的流行病學分析表明，由 IBV引發(fā)的死亡率約為 29%[10]。2017年入冬以來，以Yamagata譜系為主IBV與IAV中的H1N1、H3N2亞型在我國區(qū)域流行，且IBV在我國很多地區(qū)成為了引起流感發(fā)生的優(yōu)勢流行毒株，嚴重影響人們的健康[11]。本文綜述了IBV最新的研究進展，旨在為疫苗的選擇使用及新型抗病毒藥物的研發(fā)提供科學依據(jù)及思路。

1 IBV的結構特性

IBV為單股負鏈分節(jié)段RNA病毒，其基因組分為8個節(jié)段，編碼11個蛋白，分別為3種聚合酶蛋白PA、PB1、PB2，核蛋白NP，非結構蛋白NS1，核輸出蛋白NS2，基質蛋白M1，離子通道蛋白BM2和3種表面糖蛋白HA、NA、NB。其中，PB1由節(jié)段1編碼，PB1是一個轉錄酶，參與RNA轉錄延伸的過程中催化核苷酸的加入[9]。PB2由節(jié)段2編碼，該蛋白是CAP依賴的核酸內切酶，參與病毒mRNA合成起始時引物的生成，即將宿主的帽子 RNA切下后轉移到自身 mRNA的5′端以起始病毒mRNA的轉錄[12]。PA由節(jié)段3編碼，主要參與病毒蛋白的磷酸化[13]。PA、PB1和 PB2一起組成流感病毒轉錄和復制所必需的RNA依賴的RNA聚合酶復合物[14]。血凝素蛋白HA由節(jié)段4編碼，HA的主要功能為識別宿主細胞膜上的唾液酸受體，促使病毒囊膜和細胞膜進行融合，為病毒入侵宿主細胞提供便利[15]。NP由節(jié)段5編碼，NP是流感病毒的核蛋白，對病毒的轉錄和復制起著關鍵的作用，是形成vRNP的主要骨架，也是區(qū)別不同類型流感病毒的主要依據(jù)之一[16]。NA和NB均由節(jié)段6編碼，NA是一種水解酶，具有水解唾液酸的活性，可將子代病毒從感染的細胞表面水解，促進子代病毒的釋放。NB包括18個氨基酸殘基組成的胞外區(qū)、22個氨基酸殘基組成的跨膜區(qū)以及 60個氨基酸殘基組成的胞內區(qū)，NB對病毒在體內的復制及傳播不是必需的[14,16]。節(jié)段7編碼M1和BM2蛋白，M1為病毒的基質蛋白，除了參與維持病毒的形狀外，還與病毒的復制效率有關，BM2則主要參與調控病毒粒子的脫殼，促進病毒RNA的釋放等[17]。NS1和NS2均由節(jié)段8編碼，NS1是一個多功能蛋白，不但對病毒的復制至關重要，還參與抑制宿主細胞中干擾素介導的天然免疫抗病毒反應[18-19]；NS2則主要參與病毒vRNP的出核[20]。另外，IBV與其他類型流感病毒的區(qū)別見表1。

2 IBV的流行病學

IBV具有季節(jié)性流行的特點，且對特殊人群易感。近年來，關于 IBV引起季節(jié)性流感的報道越來越多，IBV存在與H1N1及H3N2共同流行的趨勢，每隔2–4年會成為流行的優(yōu)勢毒株，且兩個譜系交替流行[9]。在我國歷史上IBV的感染高峰主要有3次，分別為1994年、1997年和2000年[21]。IBV不像IAV在自然界中存在中間宿主，因此不會引起流感大流行[22]。IBV除具有季節(jié)性局部流行的特點外，尤其對兒童、青少年及老人等特殊群體易感，Koutsakos等[23]對英國 2012–2013年間IBV感染人群年齡統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，主要集中在5–14歲；研究人員對 2008年澳大利亞季節(jié)性流感的調查中發(fā)現(xiàn)，54%的發(fā)病人群是由IBV引起的，且IBV感染者多數(shù)為兒童[24]，泰國[25]、蘇格蘭[26]、吉隆坡等[27]地也存在類似的情況，我國也不例外[28]。兒童自身抵抗力差，感染流感病毒后若得不到及時救治還會引發(fā)細菌的繼發(fā)性感染[29]，誘發(fā)心臟疾病，造成死亡。據(jù)美國流感研究與監(jiān)測中心報道，2010–2011年間因流感病毒感染死亡的兒童病例中被確診為IBV感染的比例高達38%[30]，中國疾病預防控制中心對我國2003–2008年流感病毒引起的死亡病例進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，超過一半以上的病例與IBV感染有關[31]。還有報道稱，IBV在兒童感染中引起的死亡率甚至高于 IAV[32]。Walther等[33]對IBV臨床感染病例研究發(fā)現(xiàn)，在B型流感兩個譜系中相對于 Yamagata系，Victoria系對兒童更易感，分析其原因發(fā)現(xiàn)與受體結合的偏好性有關，即Yamagata系主要結合α-2,6唾液酸，Victoria系既能結合α-2,6唾液酸，還可以結合α-2,3唾液酸；呼吸道中的唾液酸會隨著年齡的變化而發(fā)生改變，兒童呼吸道中主要含與Victoria系偏好結合的α-2,3唾液酸受體，而成年人呼吸道中主要含有與Yamagata系偏好結合的α-2,6唾液酸受體，這樣就造成了 Victoria系對兒童更易感的現(xiàn)象存在。

2017年入冬以來，我國大范圍暴發(fā)流感疫情，根據(jù)國家流感中心流感周報 (http://ivdc.chinacdc.cn/cnic/zyzx/lgzb/) 發(fā)布的數(shù)據(jù)，對2017年第1周至2018年第12周次 (共64周) 數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，2017年第 1–46周，我國的南北地區(qū)流感的發(fā)生情況存在一定的差異。南部地區(qū)主要有3個高峰期，即第9–22周，主要以IBV的Victoria譜系與 H1N1共同流行為特征；25–40周為第2個高峰期，則出現(xiàn)了主要以 H3N2為優(yōu)勢毒株的特征；第41周至次年第12周為第3個高峰期，主要以IBV的Yamagata譜系與H1N1共同流行為特征 (圖 1A)。北部地區(qū)的第 1–15周，呈現(xiàn)出H3N2與 H1N1共同流行的特點，且具有 H1N1逐漸取代H3N2的趨勢。第16–46周間，北部地區(qū)流感病毒的檢出率一直處于較低水平 (圖1B)。2017年的第47周至2018年的第8周，無論是南部還是北部地區(qū)，流感均進入高發(fā)期，尤其在 52周前后達到了發(fā)病高峰，主要流行的是 IBV的Yamagata譜系與H1N1為共同流行優(yōu)勢毒株；另外，我國南部地區(qū)還分離出了Victoria譜系毒株，所占比例較少。

3 IBV的免疫學

3.1 IBV誘發(fā)的天然免疫應答

流感病毒感染宿主后，首先通過HA與細胞表面的唾液酸受體結合，介導了病毒的吸附與進入，但與IAV不同，IBV的HA與唾液酸受體的結合力較弱[23-34]。IBV病毒進入宿主后，首先觸發(fā)的是機體的天然免疫應答，且誘發(fā)的天然免疫應答比IAV更早更快[35]，Trevor等[36]認為這與入核時間有關，IBV的vRNP是通過細胞內吞作用的前段即初級內體 (Early endosome) 入核，而IAV的vRNP則是通過細胞內吞作用的中段即次級內體 (Late endosome) 入核，因此IBV誘發(fā)了更早更快的宿主天然免疫應答。有報道稱，IBV在 DC細胞中誘發(fā)的干擾素不但比 IAV早 (IBV感染后2–4 h干擾素-λ的mRNA即可達到峰值，而IAV感染后誘發(fā)的干擾素-λ的mRNA卻在8–16 h達到峰值)，而且干擾素的產(chǎn)生與病毒的復制及轉錄無關[4]。IBV引起的宿主天然免疫應答主要是通過RIG-I介導的信號通路完成的，其機制為NS1蛋白的 N端與 TRIM25發(fā)生結合，進一步形成RIG-I/TRIM25/NS1三元復合物，阻止了NS1的C端對RIG-I泛素化的抑制，從而保證了RIG-I迅速發(fā)生泛素化并定位于線粒體，將信號向下游傳導，引起下游轉錄因子的活化，引發(fā)了宿主中大量炎癥因子、干擾素及干擾素誘導基因等免疫因子的表達[37]。另有報道指出，MDA-5介導的信號通路在IBV引起的天然免疫應答中也起到了一定的輔助作用[38]。干擾素誘導基因PKR在細胞及動物水平上均能抑制IBV的復制，而PKR的產(chǎn)生則依賴于vRNP在細胞質內的出現(xiàn)，且vRNP在體外也可以激活PKR的生物活性[21]。

3.2 IBV誘發(fā)的體液免疫應答

與IAV相同，IBV誘發(fā)的抗體主要是針對HA蛋白產(chǎn)生的，HA中存在 4個主要抗原表位，主要位于其頭部的球狀區(qū)，分別為第 116–137位、141–150 位、162–167 位和 194–202 位氨基酸[39]。盡管IBV的不同分支的HA抗原性不同，但是針對HA的抗體仍具有一定的交叉保護作用，這可能是因為原始抗原痕跡相近引起的[40-41]，除了HA外，NA也能誘發(fā)產(chǎn)生中和抗體并保護小鼠抵抗亞致死量IBV的攻擊，且IBV Yamagata分支NA誘發(fā)的中和抗體還可以抵抗Victoria分支的感染，具有交叉免疫保護的功能[41]。

針對IBV的廣泛中和抗體是近年來研究的熱點。首次報道的 IBV廣泛中和單克隆抗體是CR8033、CR8071和CR9114，這3種單抗均可以保護小鼠免受兩個不同分支 IBV的致死劑量攻擊，其中CR8033和CR8071分別識別HA頭部的兩個不同保守抗原表位，而 CR9114則識別 HA莖部的保守性抗原表位，并且對IAV (包括H1、H3、H5、H7和H9亞型) 也具有交叉保護。另外，單抗CR8033和單抗CR8071是通過抑制子代IBV的釋放而不是抑制IBV的進入實現(xiàn)其抗病毒功能的[42]，還有研究人員篩選到了針對 IBV的單抗46B8，該單抗也具有廣泛的中和IBV的作用，其結合位點為HA的保守性抗原表位，通過阻斷HA與唾液酸受體的結合發(fā)揮中和作用。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，46B8還可以保護小鼠抵抗HA結合位點 (301位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼? 突變的致死劑量的IBV的攻擊，隨后研究人員開發(fā)了一種更廣泛的IBV單抗C12G6，該單抗具有比先前文獻報道的廣泛單抗和抗病毒藥奧司他韋更廣泛有效的特點，可以保護小鼠及雪貂免受兩種分支的IBV致死劑量的攻擊，且該單抗與奧司他韋聯(lián)用時，還可以提高奧司他韋的療效，具有輔助治療IBV感染的效果[43]。除了HA外，還有研究人員篩選到了針對 NA的單抗 1F2，該單抗不但具有廣泛的抗兩個分支IBV的特點，而且其保護及治療效果比目前的標準治療方案更好[44]。

3.3 IBV誘發(fā)的細胞免疫應答

關于CD8+T細胞在IAV感染后的免疫應答中的作用目前已廣泛研究，但CD8+T細胞在IBV感染過程中的作用卻鮮有報道。研究人員將小鼠的抗體應答相關基因敲除后進行IBV感染發(fā)現(xiàn)，該小鼠仍然能通過 CD8+T細胞依賴的途徑抵抗IBV的攻擊，且初次感染后還可以通過CD8+T細胞和 CD4+T細胞依賴的途徑保護小鼠免受 IBV的二次感染[45]，該結果說明同IAV類似，IBV感染后可以引起機體的 T細胞免疫應答，并在抗IBV感染的過程中發(fā)揮著重要的作用。通過與IAV的同功序列進行比較發(fā)現(xiàn)，IBV的核蛋白 NP上也具有保守的T細胞抗原表位，包括第30–38位、56–68位、82–94位及 263–271位等[46-47]，隨后又有研究人員證明僅第30–38位可以誘導IBV多克隆細胞毒性T淋巴細胞 (CTLs) 中干擾素γ的產(chǎn)生[48]。另外，部分IAV的PB1的保守性T細胞表位在IBV的PB1中也存在，說明該表位是保守的，但針對該表位的T細胞反應是否具有交叉反應及交叉保護活性，還需要進一步驗證[49]。除了NP、PB1外，HA上也存在CD4+T細胞表位，而且該表位在IAV的16個亞型及IBV中較保守且針對該表位的CD4+T細胞反應具有交叉保護活性[50]。

4 IBV的防治

目前已注冊的流感病毒治療的藥物分為兩類，分別為金剛烷胺類及神經(jīng)氨酸酶抑制劑類(NAIs)。其中金剛烷胺類主要通過抑制IAV的M2的離子通道功能實現(xiàn)其抗病毒作用，但不能抑制IBV的BM2的功能，主要因為IBV的BM2上的極性氨基酸殘基阻斷了該藥物與離子通道孔的接觸，因此，金剛烷胺類藥物不能用于B型流感的治療[51]。抑制劑類藥物，如奧司他韋和扎那米韋，可通過抑制神經(jīng)氨酸酶NA的水解活性來阻斷子代病毒的釋放，對IAV和IBV都有抑制作用，但隨著耐藥毒株的出現(xiàn)，其抗病毒效果也呈現(xiàn)出一定的差異。通過對臨床治療數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，扎那米韋抗IBV的效果要優(yōu)于奧司他韋[10]。

雖然抑制劑類藥物對流感病毒有良好的治療效果，但長期使用會導致耐藥毒株的產(chǎn)生，且目前已出現(xiàn)多株耐藥毒株 (如 NA蛋白中 E119A、R152K、D198N、I222T、H274Y和 R371K等突變) 的報道[10,52-53]，這些耐藥毒株將來是否會在人群中造成感染并流行，現(xiàn)在還不可預知，因此近年來已有研究人員進行了針對IBV的廣泛中和抗體的研發(fā)，該抗體的使用可以顯著提高人們對IBV的預防及治療效果。

首例報道的廣泛中和單克隆抗體 CR8033、CR8071和CR9114可以完全保護小鼠抵御兩個不同分支 IBV致死劑量的攻擊，且 CR8033和CR8071可以中和全部 IBV的測試株。由于CR8033、CR8071和 CR9114分別識別頭部受體結合域、頭部底部的殘留酯酶域和莖部高度保守的抗原表位，不存在抗原表位的競爭結合，且這3株抗體都具有顯著的保護性，提示 3株抗體可聯(lián)合使用，以增強效果[42]。5A7是針對IBV HA莖部保守型抗原表位的另一株單克隆抗體，其識別位點與CR9114不同，較CR9114的識別位點更保守，可以中和覆蓋1980年至近年的IBV毒株，保護小鼠免受致死劑量的 B/Victoria/2/87類似株的攻擊[54]。C12G6為人源化的鼠單克隆抗體，為人IgG1的Fc區(qū)與鼠IgG的V區(qū)嵌合體，減少了異源性抗體的免疫原性，同時保留了親本抗體特異性結合抗原的能力，可以廣泛中和1940年后的祖先譜系至近年的兩個分支的 IBV，可以保護小鼠和雪貂抵御致死劑量兩個分支的IBV的攻擊。與之前報道的廣泛單克隆相比，C12G6具有更好的治療效果，包括致死劑量攻擊后的完全保護、體重無顯著差異及顯著降低的病毒滴度。C12G6具有很高的血凝抑制效價，說明其結合的抗原表位位于HA的頭部區(qū)域，與CR8033相似，C12G6識別的抗原表位與受體結合域較接近，在IBV中高度保守。C12G6與CR8033存在競爭結合，顯示二者識別的抗原表位存在一定的重疊區(qū)域。C12G6可通過阻止病毒進入、膜融合及病毒釋放等多方式抑制病毒，同時還表現(xiàn)出分支特異性的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用 (ADCC)，在體外具有強大的補體依賴的細胞毒作用，為抗 IBV中和抗體在臨床中的應用奠定了理論基礎[55-56]。與 C12G6、CR8033與 CR8071抗體相似，46B8也通過與HA頭部區(qū)域的抗體表位結合，阻止病毒與受體的結合、膜融合及病毒釋放等，可體外誘導ADCC，完全保護小鼠抵御感染后72 h的致死劑量IBV的攻擊[57]。除了HA外，NA也具有保守的抗原表位，并可誘導具有中和活性的單克隆抗體1F2，降低兩個分支的IBV攻擊后小鼠的發(fā)病率及死亡率[44]。與奧司他韋相比，抗 NA的單克隆抗體HCA2在治療致死劑量IBV攻擊72 h后表現(xiàn)出更好的效果，對兩株藥物耐受突變株IBV (E117D 和D197E) 也有治療效果[58-59]。上述廣泛中和抗體證明了IBV的HA及NA蛋白中存在保守性中和抗體表位，這些抗體有望研發(fā)為有價值的臨床治療及預防產(chǎn)品，為B型流感病毒的防控提供理論基礎。

表1 不同類型流感病毒的比較Table 1 Comparison of different types of influenza viruses

除了研發(fā)新型抗流感病毒的化學藥物及中和抗體外，對易感人群在流感高發(fā)季節(jié)進行疫苗免疫是預防流感發(fā)生的最有效措施。免疫疫苗可促進機體產(chǎn)生針對流感病毒HA蛋白頭部區(qū)域的主要中和抗體，保護機體免受流感病毒的攻擊，同時機體也會產(chǎn)生針對NA的抗體，所占比例較少。目前使用流感疫苗主要是三價疫苗，包括針對IAV中的H1N1、H3N2和IBV中的Yamagata譜系或 Victoria譜系中的一種[37]。商品化疫苗的大量生產(chǎn)一般需要耗時數(shù)月，需要在流感高發(fā)季到來之前進行儲備，所以 WHO會對未來的流行毒株進行預測并把預測結果推薦給疫苗生產(chǎn)企業(yè)，因此難免會出現(xiàn)預測結果與實際流行毒株不符的現(xiàn)象。根據(jù)科羅拉多大學醫(yī)學院 Ambrose等[66]對 2001–2011年世界衛(wèi)生組織對流感流行季的疫苗預測結果調查發(fā)現(xiàn)，10年間僅約50%預測結果是準確的。本季 WHO推薦北半球使用的三價疫苗包含IAV中的H1N1、H3N2和IBV中的Victoria譜系 (表2)，沒有Yamagata譜系成分，且Victoria譜系與 Yamagata譜系之間幾乎不存在免疫交叉保護[67]，因此不能對 2017年入冬以來我國發(fā)生的 Yamagata譜系引起的 B型流感起到有效的預防。除此之外，我國較低的流感病毒疫苗接種率(僅為 1.9%[68]) 也是流感病毒大面積流行的另一個原因。2018年2月WHO推薦了2018–2019年北半球季節(jié)性流感疫苗的組分，與往年不同的是此次優(yōu)先推薦四價疫苗成分 (包含B-Yamagata譜系和B-Victoria譜系)，再推薦三價疫苗成分。與2017–2018年相比，IAV 中的 H3N2組分由 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 (H3N2) 病毒株替換了A/Hong Kong/4801/2014病毒株，IBV中的Victoria譜系組分也由B/Colorado/06/2017病毒株替換了 B/Brisbane/60/2008病毒株[63]。四價疫苗更有利于季節(jié)性流感的防控，目前已在國外推廣使用，但在我國大陸還未經(jīng)批準上市。據(jù)中國國家衛(wèi)生健康委員會網(wǎng)站公布顯示，我國也在加快四價疫苗的研發(fā)進度，且中國食品藥品監(jiān)督局也把流感四價疫苗的評審納入優(yōu)先評審行列，有望于2018年秋冬流感流行季節(jié)推廣使用。

圖1 2017–2018年我國流感病毒流行情況Fig. 1 The distribution of influenza virus strains in China (2017–2018). (A) The Southern provinces. (B) The Northern provinces.

表2 世界衛(wèi)生組織優(yōu)先推薦季節(jié)性流感病毒疫苗組分Table 2 The WHO recommended composition of influenza virus vaccines in influenza season

另外，研究人員還根據(jù)NS1截短的IAV弱毒疫苗的研發(fā)經(jīng)驗，開發(fā)了IBV的NS1截短的弱毒疫苗，可在小鼠體內產(chǎn)生針對IBV的免疫保護[19]，但該疫苗目前尚處于研究階段。

5 小結與展望

與IAV相比，人們對IBV的認知和關注較少。雖然IBV不會引起大流行性的流感暴發(fā)，但其引發(fā)的季節(jié)性流感同樣不可小覷。不但給兒童、青少年等易感人群的健康帶來了嚴重的威脅，而且該病毒會引發(fā)較嚴重的并發(fā)癥，因此研究人員應更加關注IBV的監(jiān)測與研究。

目前關于IBV的機理及應用研究相對滯后，存在較多問題亟待解決。未來我們需要加強對IBV的基礎理論研究，包括IBV的進化特征、致病機理及免疫、病毒與宿主相互作用機制等，為疫苗研發(fā)及抗病毒藥物的篩選提供理論基礎及研發(fā)思路。我們可通過對IBV流行病學的監(jiān)測來預測優(yōu)勢疫苗毒株；對IBV的致病機理及與宿主的相互作用的深入研究來解析病毒的致病性；對IBV免疫學的探究將便于我們篩選廣泛的中和抗體及研發(fā)有效的通用疫苗等。在前期研究的基礎上，繼續(xù)開展B型流感病毒與宿主相互作用機制研究是我們下一步的工作重點。

綜上，隨著全球流感監(jiān)測網(wǎng)絡更加系統(tǒng)健全，B型流感病毒感染相關研究及監(jiān)測會不斷地補充完善。加強對B型流感病毒的關注，開展更多的相關研究，為B型流感抗病毒藥物的推薦和新型疫苗的研發(fā)提供更多的科學依據(jù)。

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