童　玲，薛　婧，魏　強

(北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京　100021)

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染機體后引發(fā)的全身性疾病。自1983年首次發(fā)現(xiàn)HIV以來，人類已與艾滋病抗爭30多年。目前全球有超過3530萬人感染 HIV，在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，艾滋病逐漸成為一種慢性病[1]?，F(xiàn)階段治療艾滋病最有效的方法是美國華裔科學家何大一在1996年提出的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)，該方法是通過聯(lián)合使用三種或三種以上的抗病毒藥物從不同方面抑制病毒的生命周期，俗稱“雞尾酒”療法。HAART可以有效地減少病毒的復制，阻止HIV病毒在體內(nèi)傳播，將血漿中的病毒RNA抑制在低水平甚至現(xiàn)有方法檢測不到的水平，從而延長患者生命，降低疾病死亡率[2]。但是由于HIV潛伏于一些細胞和組織中，形成病毒的潛伏庫，HAART并不能有效清除潛伏庫中的病毒，一旦停藥，病毒便會發(fā)生反彈。因此，如何尋找HIV的潛伏庫、徹底清除宿主細胞中潛伏的HIV，是近年來艾滋病治療研究領(lǐng)域的熱點問題。

1　HIV潛伏庫的形成

了解HIV潛伏庫的形成，是研究HIV潛伏庫治療策略的重要前提。靜息CD4+T細胞被認為是HIV的主要潛伏細胞，HIV DNA以非整合型和整合型兩種形式潛伏在靜息CD4+T細胞中[3]。

非整合型HIV DNA前病毒是指HIV DNA未整合進宿主基因組中，其原因可能是在CD4+T 細胞中HIV前病毒整合受到抑制，但在一些細胞因子和相關(guān)因素的刺激下可以使CD4+T細胞活化，產(chǎn)生病毒顆粒。但由于這種形式的前病毒并不穩(wěn)定，半衰期較短，只能持續(xù)數(shù)周，因此不是HIV潛伏庫形成的原因[4]。

整合形式HIV DNA前病毒[3]，病毒的DNA已整合入宿主基因組，但是在靜息期CD4+T細胞中HIV前病毒的基因表達受到多因素的影響，例如，在轉(zhuǎn)錄水平上，某些轉(zhuǎn)錄因子在靜息CD4+T細胞中的濃度低(NF-κB、NF-AT)，或者由于存在大量的抑制因子(YY1、LSF)轉(zhuǎn)錄因子活性降低，不能有效地與HIV的LTR結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用，影響HIV基因轉(zhuǎn)錄[5-7]。在翻譯水平上，由于靜息CD4+T細胞產(chǎn)生的特定微小RNA (miRNA)，通過靶向結(jié)合mRNA后降解mRNA或抑制mRNA翻譯，影響病毒顆粒包裝所需蛋白的形成，從而表現(xiàn)為不產(chǎn)生病毒顆粒的潛伏狀態(tài)[8]。此外，HIV整合位點的染色質(zhì)環(huán)境也影響HIV基因的表達[9]。由于上述多個水平共同影響，靜息CD4+T細胞中整合的HIV前病毒的基因表達處于一個較低水平，幾乎沒有病毒產(chǎn)生或僅有極少量病毒顆粒產(chǎn)生，便于其逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊和抗病毒藥物的作用，因此整合型的HIV DNA前病毒十分穩(wěn)定，半衰期較長，被認為是形成HIV潛伏庫的主要原因[10]。

2　HIV的潛伏庫

2.1　HIV的潛伏細胞

靜息CD4+T細胞是目前最具特征的HIV潛伏感染細胞[5]。靜息CD4+T細胞以初始T細胞和記憶性T細胞兩種形式存在[11]。在病毒進入細胞后，靜息的T細胞中缺乏病毒反轉(zhuǎn)錄和進入細胞核的條件，病毒無法完成整個復制周期，這些初始的T細胞最終會轉(zhuǎn)變靜息的記憶T細胞[12]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，盡管不同的細胞亞群都能發(fā)現(xiàn)整合的HIV DNA，但是大部分存在于中心記憶T細胞(TCM)和過渡期記憶T細胞 (TTM)。其中，TCM是主要的儲存庫，可以保持長時間低水平的復制；TTM保持自我平衡的增殖狀態(tài)，成為非常穩(wěn)定的病毒儲存庫。

HIV的潛伏庫不僅存在于靜息期CD4+T細胞，樹突狀細胞和巨噬細胞[10]也是HIV的潛伏庫。盡管只有一小部分(約1%)樹突狀細胞中有潛伏的HIV DNA，但在合適的刺激條件下它們同樣可以被激活，釋放病毒顆粒[14]。巨噬細胞通過吞噬受感染的CD4+T細胞后被感染；研究還發(fā)現(xiàn)在T細胞不存在的情況下巨噬細胞仍可以被HIV感染，同時病毒還可以自主在巨噬細胞中進行復制[15]。即使進行HAART，感染的巨噬細胞仍然可以持續(xù)存在；最重要的是，即使沒有T細胞，它們也可以在治療中斷時重新啟動和維持感染[16]。不僅如此，感染HIV的巨噬細胞可以通過融合或旁分泌的形式將病毒散播給CD4+T細胞，促進了HIV的潛伏感染和潛伏庫的擴大[17-18]。因此，要想達到艾滋病的功能性治愈，HIV潛伏庫的治療必須靶向多種細胞類型。

2.2　HIV的潛伏組織

由于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物物理性質(zhì)的限制，其無法穿透人體內(nèi)的生理屏障，組織利用度降低，故在HAART治療中，這些藥物無法到達的組織，成為了HIV的“避難所”[19]。如體內(nèi)血-腦屏障、血-睪屏障、血-組織屏障的存在，限制了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物進入相應部位發(fā)揮作用，因此中樞神經(jīng)系統(tǒng)和睪丸等組織成為HIV-1潛伏感染的“避難所”[20]。

此外，一些組織因其自身的免疫學特性，成為HIV的“避難所”。人體內(nèi)僅有2%淋巴細胞分布于血液循環(huán)中，其余淋巴細胞廣泛分布于淋巴器官和組織中，如脾臟、淋巴結(jié)、腸道相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue GALT)[21-22]。這些部位是HIV復制的主要場所，也可成為停藥后病毒反彈的源頭。有研究表明[23-24]，GALT和淋巴結(jié)比外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中感染細胞的比例更高，同時發(fā)現(xiàn)在HAART治療期間，這些淋巴組織的藥物濃度低于外周血，淋巴組織中仍然存在持續(xù)微量的病毒復制，即使在進行長期藥物治療后這些部位依然有大量的病毒DNA+細胞與病毒RNA+細胞，提示淋巴組織是HIV的主要潛伏部位。

3　HIV的潛伏庫的治療策略

圖1　將HIV從潛伏庫中激活Fig.1　Activation of HIV from the latent reservoir

隨著對HIV潛伏庫的認識不斷深入，近年來，研究人員提出了多種針對HIV潛伏庫的治療策略。以期縮小乃至徹底清除HIV的潛伏庫，達到治愈艾滋病的目的。

3.1　休克和殺戮(Shock and Kill)

由于潛伏感染的靜息CD4+T細胞不表達病毒相關(guān)蛋白，因此可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除。如果將這些靜息細胞激活，那么它們會為潛伏其中的HIV提供復制條件，啟動病毒復制：促進HIV RNA合成，產(chǎn)生HIV相關(guān)蛋白并釋放病毒顆粒。最終這些激活的細胞會被病毒殺死或者被機體的免疫系統(tǒng)識別并清除。據(jù)此，研究者們提出一種新的治療策略，即利用藥物將所有的潛伏感染細胞都激活，再利用機體免疫系統(tǒng)或相關(guān)藥物將這些細胞殺死，最終達到清除病毒潛伏庫的目的。這種治療策略被稱為“Shock and Kill”(圖1)[25]。

由于“Shock and Kill”療法的提出，HIV潛伏庫激活劑(HIV latency-reversing agent，LRAs)成為目前研究的熱點。LRAs的作用位點靶向HIV基因表達的多個水平[26]：可以作用于轉(zhuǎn)錄水平(如TLR激動劑[27-28]、PKC通路調(diào)節(jié)劑、BRD抑制劑[29]等)；也可以作用于組蛋白修飾水平(如組蛋白去乙?；福M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[30]等)。例如，最近Boehm等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2是HIV-1的轉(zhuǎn)錄抑制因子，抑制潛伏病毒的基因表達。當敲除SMYD2的基因或使用SMYD2的抑制劑可以激活或喚醒細胞中潛在的HIV-1病毒，因此SMYD2可以作為休克和殺戮策略的治療靶點。這些LRAs均旨在促進潛伏感染細胞中HIV的基因表達，改變HIV低水平表達狀態(tài)。通過與抗病毒藥物的聯(lián)用，最終實現(xiàn)“Shock and Kill”。

研究學者還發(fā)現(xiàn)一些作用于其他疾病的藥物，對潛伏庫細胞的激活有很好的效果。GS-9620是吉利德公司生產(chǎn)的一種應用于乙肝藥物，它作用于Toll-like receptor 7(TLR7)[32]，增加了CD4細胞的復制。由于CD4細胞的增多，潛伏HIV獲得更多可感染的細胞，從而激活潛伏的病毒，達到“Shock and Kill”的目的。GS-9620與HAART的聯(lián)用在動物試驗中取得良好的療效[33]。

盡管目前的艾滋病潛伏庫激活藥物并不能將所有的潛伏感染病毒通過“Shock and Kill”清除，但它們的應用有效的縮小了HIV潛伏庫。

3.2　免疫治療

免疫系統(tǒng)在病毒潛伏庫的建立和維持中發(fā)揮重要的作用，因此免疫治療是HIV治療策略研究中的重點。激活的CD4+T細胞表面表達多種免疫抑制受體，當其與配體結(jié)合以后，激活的CD4+T細胞功能會抑制，變?yōu)槲醇せ顮顟B(tài)，促進了HIV的潛伏。一種治療策略是將阻斷免疫抑制受體與配體結(jié)合，使細胞保持激活狀態(tài)[34]。程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)，是一種重要的免疫抑制分子，其T cell功能耗竭的標志[35]。PD-1及其配體PDL-1、PDL-2抑制劑在腫瘤領(lǐng)域有著重要作用[36]。由于激活的細胞比靜息期的細胞更容易被感染HIV，表達PD-1的激活細胞易轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲腥镜募毎?，因此HIV潛伏庫的大小，與表達PD-1的CD4細胞數(shù)呈正相關(guān)[37-38]。綜上所述，PD-1抑制劑可以作為藥物來干預HIV潛伏庫的建立與維持。

在慢性感染中，I型干擾素(IFN-I)一方面會增加CCR5和PD-1的表達、引起炎癥反應、改變T細胞穩(wěn)態(tài)、使T細胞功能失調(diào)，另一方面高表達的IFN-I會影響機體免疫功能重建[39-42]。因此，阻斷IFN信號途徑可以加強T細胞恢復并對縮小HIV潛伏庫有重要作用[43]。有研究人員證明在慢性HIV感染過程中阻斷體內(nèi)IFN-I信號可以削弱HIV驅(qū)動的免疫激活，下調(diào)T細胞衰竭標記物的表達，重新恢復特異性的CD8+T細胞的功能，并導致病毒復制水平下降?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒療法與IFN-I阻斷聯(lián)合可以加速對病毒的抑制，進一步減少病毒載量，相比于單獨使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法來說，聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法可以重新恢復免疫功能，縮小慢性HIV感染過程中的病毒儲存庫，延緩抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后的病毒反彈[44]，這表明阻斷IFN-I有望成為治療HIV感染的一種新方法。

白介素-2(IL-2)是免疫系統(tǒng)中的一種細胞因子，能夠刺激殺傷性T細胞發(fā)揮作用。近日，來自凱斯西儲大學醫(yī)學院的研究人員把IL-2與前期實驗中開發(fā)的一種靶向作用HIV的工程化單克隆抗體相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)這種新型組合療法能夠減少潛在的HIV[45]。白介素-2能夠激活機體的殺傷性T細胞并且激活潛伏狀態(tài)的HIV；而能夠中和HIV的單克隆抗體則是一種特殊的克隆蛋白抗體，其能夠結(jié)合到HIV表面并且阻斷HIV對機體免疫細胞的感染，同時單克隆抗體還能夠幫助殺傷性T細胞對HIV感染的細胞實施攻擊，讓白介素-2更好的發(fā)揮作用，使得感染的細胞從潛伏狀態(tài)開始表達大量病毒。因此，白介素-2組合療法能夠有效降低潛在的HIV病毒庫的規(guī)模。

治療性疫苗的研究，也是免疫治療的一個重要方面[34]。人體內(nèi)的CD8+的T細胞可以通過選擇性殺死產(chǎn)生病毒的細胞達到控制HIV的目的。通過治療性疫苗激活免疫細胞，增強宿主體內(nèi)病毒特異性CD8+的T淋巴細胞反應[46]，使機體的免疫系統(tǒng)更快速有效的殺死攜帶病毒的細胞，并且抵御HIV的感染。通過免疫治療可以調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，加強對潛伏感染細胞的清除，從而縮小HIV潛伏庫，實現(xiàn)對HIV的有效控制。

3.3　基因治療

“柏林病人”是全球唯一一例艾滋病治愈患者，他通過移植CCR5特定基因32位堿基缺失的純合子供體骨髓，體內(nèi)不再產(chǎn)生新的HIV，實現(xiàn)了艾滋病的治愈[47]。CCR5特定基因32位堿基缺失的人對HIV天然耐受[48]，通過骨髓移植，該感染者也獲得對HIV耐受的T細胞，該細胞對HIV的復制和感染產(chǎn)生抑制?！鞍亓植∪恕钡某晒μ峁┝税滩〉闹委熜虏呗?，研究者嘗試復制這一案例，但目前仍未有成功的病例出現(xiàn)[49]。另外由于該方法費用高昂，并且治療過程中的藥物與射線對人體的免疫系統(tǒng)傷害過大，其臨床應用價值不大。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，采用鋅指蛋白[50]或CRISPR/Cas9[51]，對HIV潛伏的基因位點進行編輯或者利用“柏林病人”的案例，對CCR5基因進行定點切割，從基因水平實現(xiàn)對HIV潛伏庫的清除是HIV治療的又一策略。CRISPR/Cas9基因剪輯技術(shù)可以簡便高效的改變生物體內(nèi)的基因，被譽為“基因組編輯的魔術(shù)手術(shù)刀”。該技術(shù)通過RNA做向?qū)?，把Cas9酶帶到相應的位置，然后用這種酶識別并切割病毒 DNA。HIV基因兩端含有長末端重復序列，利用CRISPR/Cas9剪斷長重復序列，便可以切除HIV的基因組[52]。研究人員通過該技術(shù)有效的清除了體外培養(yǎng)的人類細胞系、艾滋病患者體內(nèi)取出的T免疫細胞以及轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的艾滋病病毒[1]。HIV基因易于突變，單靶點基因編輯有可能會出現(xiàn)病毒逃逸現(xiàn)象，研究人員還提出了多靶點基因編輯的新思路，針對HIV轉(zhuǎn)錄區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計了不同的向?qū)NA，可引導Cas9酶切割目標基因?qū)崿F(xiàn)多靶點切除，顯著增加了HIV的剔除效率。并且這種病毒基因清除方法不影響靶細胞的存活和功能，達到“只殺病毒不殺細胞”的目的[53]。此外，也有學者[54]利用CRISPR/Cas9直接對HIV RNA進行編輯，特異性清除潛伏感染病毒，阻止HIV整合進宿主細胞，阻斷HIV的傳播。

盡管目前通過基因療法不能徹底清除感染者體內(nèi)的艾滋病病毒，但是可以明顯降低體內(nèi)潛伏的病毒。因此，隨著基因編輯技術(shù)的不斷進步，基因療法將是一種有希望的艾滋病治療策略。

3.4　其他療法

對比未經(jīng)治療的患者，早期的抗逆病毒治療(ART)可以有效控制HIV-1的復制，阻止更多的細胞被HIV感染。但其不能影響已經(jīng)感染的細胞，HIV潛伏庫依然會形成[55]。有研究者發(fā)現(xiàn)[56]，在更早的時間(感染后3 d)給感染SIV的動物注射疫苗，SIV特異性的殺傷細胞會在細胞轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止狀態(tài)前殺死感染細胞，因此阻止HIV潛伏庫的形成。這一發(fā)現(xiàn)提示我們，早期的ART治療可能還是不夠早。越早的ART治療越能有效阻止HIV潛伏庫的形成。有學者提出預暴露前預防(PrEP)，和暴露后預防(PEP)兩個概念[34]，即在進行可能暴露HIV的危險行為前和暴露HIV后立即服用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。PrEP和PEP可以有效降低感染艾滋病的危險，在第一個HIV感染細胞出現(xiàn)時就能有效殺死細胞，阻止HIV的潛伏。

如何有效地找到、識別、并且攻擊這些病毒“避難所”，徹底清除潛伏的HIV病毒，一直是艾滋病治療的研究熱點，但是研究進展緩慢。近期，研究人員發(fā)現(xiàn)CD32 a蛋白可能是HIV潛伏細胞的重要表面標記，通過將熒光標記的HIV將靜息期T細胞暴露在熒光顯微鏡下，然后利用單細胞測序手段，檢測其基因表達差異。發(fā)現(xiàn)靜息期T細胞的表達CD32 a的基因被打開，而未被感染的細胞幾乎找不到它。并且，研究人員還發(fā)現(xiàn)，在活躍復制HIV病毒的細胞中，這個蛋白的表達卻并不顯著[57]。因此，CD32 a可能是HIV潛伏細胞的特異性表面標記，可以將潛伏感染細胞與其他細胞區(qū)分開。針對CD32 a開展靶標藥物設(shè)計，可以達到特異性殺死潛伏感染細胞的目的，實現(xiàn)HIV潛伏庫的有效清除。

4　小結(jié)

針對HIV潛伏庫，研究學者所提出的多種治療策略雖然不能徹底清除HIV潛伏庫，但是也在縮小潛伏庫，抑制HIV感染等方面具有重要價值，為實現(xiàn)艾滋病的功能性治愈奠定基礎(chǔ)。目前，HIV潛伏庫的清除仍面臨諸多挑戰(zhàn)，因此，我們需要探索出一種高效、準確的方法去檢測患者體內(nèi)HIV潛伏庫，更加深入的研究HIV潛伏庫的形成機制及其特征，以期為艾滋病的臨床治療提供新思路。一旦HIV潛伏庫可以被徹底清除，人們有望實現(xiàn)艾滋病的功能性治愈。

參考文獻：