魏　強，程　潔，胡玉敬，邊艷珠*，董長征

(1.河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學科，石家莊　050051； 2.河北省人民醫(yī)院口腔科，石家莊　050051； 3.河北省人民醫(yī)院神經外科，石家莊　050051)

癲癇是一種臨床上表現為反復性、刻板性、暫時性及發(fā)作性的腦部疾病。由于感覺、意識、精神、運動、行為等發(fā)生了功能性障礙，給患者帶來沉重的心理及生理負擔[1-3]。因此深入的研究癲癇的發(fā)病機制及新治療藥物的開發(fā)至關重要。甘草酸是從甘草中提取出來的一種活性三萜皂苷類物質，具有保肝、降血脂、降血壓、抗病毒、免疫調節(jié)等作用[4-5]。同時，相關研究顯示甘草酸也具有神經保護作用[6-7]，還發(fā)現甘草酸作為高遷移率族蛋白1抑制劑能夠減輕癲癇對大鼠血腦屏障完整性的破壞[8]，但對于甘草酸是否能夠抑制癲癇引起大鼠海馬神經損傷尚未見報道，因此本研究將對此展開探討。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

清潔級SD雄性大鼠45只，4周齡，體重(200±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2012-0002]；實驗在河北省人民醫(yī)院實驗動物中心進行[SYXK(冀)2013-0056]。溫度21℃～25℃，自由飲食飲水，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2　主要試劑及儀器

BCA法蛋白定量試劑盒，細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒，細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，Nissl染色試劑盒，細胞膜電位檢測試劑盒，caspase 3，9活性檢測試劑盒，TUNEL試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；兔抗cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1多克隆抗體均購于美國Abcam公司；BX53熒光顯微鏡購于美國Olympus公司；轉印電泳儀，GelDocEZ凝膠成像系統(tǒng)均購于美國Bio-Rad公司。

1.3　實驗方法

1.3.1癲癇模型的制備[9-10]

取33只大鼠腹腔注射127 mg/kg氯化鋰，24 h后腹腔注射1 mg/kg阿托品，30 min后腹腔注射30 mg/kg匹魯卡品，并觀察大鼠行為，同時根據國際通用癲癇發(fā)作Racine分級進行判斷，達到 IV級以上的說明癲癇點燃模型成功。大鼠癲癇持續(xù)發(fā)作30 min后給予10 mg/kg地西泮，直至癲癇發(fā)作終止，從而對癲癇進行控制。其中癲癇發(fā)作4級以上的大鼠有28只，3級以下的有3只，2只在造模過程中死亡。

1.3.2分組及給藥

將造模成功的28只大鼠隨機選取24只分為癲癇組及甘草酸組，另外選取12只不做任何處理的大鼠作為正常對照組，甘草酸組在造模成功后灌胃給予30 mg/kg甘草酸，癲癇組及正常對照組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。大鼠麻醉后斷頭取腦組織，并在4℃條件下鈍性分離大鼠雙側海馬組織，在液氮罐中保存待測。

1.3.3Nissl法檢測細胞損傷

海馬組織切片于二甲苯、100%、95%、80%、70%酒精中浸泡2 min后，PBS洗滌，1%甲苯胺藍染色40 min，后分色，二甲苯、梯度酒精透明，封片，最后于顯微鏡下觀察并對尼氏陽性的細胞進行計數。

1.3.4TUNEL法檢測細胞凋亡

將海馬組織切片置于二甲苯、100%、95%、90%、80%、70%的酒精中各浸泡5 min，后蛋白酶K室溫消化1 h、PBS洗滌3次，按TUNEL反應試劑盒步驟對切片進行染色、終止反應、封片等，最后于熒光顯微鏡下觀察洗滌凋亡數目。經TUNEL染色上的陽性細胞呈棕黃色或棕褐色。

1.3.5比色法檢測caspase 3、9活性

將海馬組織勻漿后加入胰蛋白酶裂解，離心收集上清液，按caspase 3、9活性檢測試劑盒說明書檢測海馬組織中caspase 3、9活性。

1.3.6Western blot檢測cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1蛋白表達將海馬組織勻漿后加入細胞裂解液裂解30 min，離心收集上清液即是總蛋白，測定蛋白濃度并定量，變性。制作濃縮膠及分離膠，蛋白上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉電泳，轉PVDF膜，一抗溶液(兔抗cleaved caspase 3、9、Bax、Bcl-2、CytC、Apaf-1多克隆抗體)孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1～2 h。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

注：與正常對照組比較，**P< 0.01；與癲癇組比較，##P< 0.01。下同。圖1　甘草酸對癲癇大鼠海馬神經元損傷及凋亡的影響(×200，n=6)Note. Compared with the normal control group,**P< 0.01. Compared with the epilepsy group,##P< 0.01.The same below.Fig.1　Effect of glycyrrhizic acid on hippocampal neuron injury and apoptosis in epileptic rats

1.4　統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1　甘草酸對癲癇大鼠海馬神經元損傷及凋亡的影響

與正常對照組比較，癲癇組神經元細胞數目減少、TUNEL陽性細胞數目增加(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組神經元細胞數目增加、TUNEL陽性細胞數目減少(P< 0.01)。(圖1)

2.2　甘草酸對癲癇大鼠海馬神經元線粒體膜電位的影響

癲癇組海馬神經元細胞線粒體膜電位較正常對照組降低(P< 0.01)；甘草酸組海馬神經元細胞線粒體膜電位較癲癇組增加(P< 0.01)。(圖2)

圖2　甘草酸對癲癇大鼠海馬神經元線粒體膜電位的影響(n=6)Fig.2　Effect of glycyrrhizic acid on mitochondrial membrane potential in hippocampal neurons of epileptic rats

2.3　甘草酸對癲癇大鼠海馬組織中Caspase 3、9活性的影響

癲癇組caspase 3、9活性較正常對照組提高(P< 0.01)；甘草酸組caspase 3活性較癲癇組降低(P< 0.01)。(表1)

表1　甘草酸對癲癇大鼠海馬組織中

2.4　甘草酸對癲癇大鼠海馬組織中cleaved-caspase 3、9蛋白表達的影響

與正常對照組比較，癲癇組cleaved-caspase 3、9表達量上調(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組cleaved-caspase 3、9表達量下調(P< 0.01)。(圖3)

圖3　甘草酸對癲癇大鼠海馬組織中c leaved-caspase 3、9蛋白表達的影響(n=6)Fig.3　Effect of glycyrrhizic acid on the expression of cleaved caspase 3, 9 proteins in the hypocampal tissues of epileptic rats

2.5　甘草酸對癲癇大鼠海馬組織中Bax及Bcl-2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，癲癇組Bax表達量上調，Bcl-2表達量下調(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組Bax表達量下調，Bcl-2表達量上調(P< 0.01)。(圖4)

圖4　甘草酸對癲癇大鼠海馬組織中Bax及Bcl-2蛋白表達的影響(n=6)Fig.4　Effect of glycyrrhizic acid on the expression of Bax and Bcl-2 proteins in the hypocampal tissues of epileptic rats

2.6　甘草酸對癲癇大鼠海馬組織中CytC/Apaf-1信號通路相關蛋白表達的影響

與正常對照組比較，癲癇組海馬神經元線粒體中CytC表達量下調(P<0.01)，細胞質中CytC、Apaf-1表達量上調(P< 0.01)；與癲癇組比較，甘草酸組海馬神經元線粒體中CytC表達量上調(P< 0.01)，細胞質中CytC、Apaf-1表達量下調(P< 0.01)。(圖5)

3　討論

癲癇是由多種因素導致大腦神經元過度放電從而引起的一種刻板性、反復性、發(fā)作性的中樞系統(tǒng)疾病，是僅次于腦血管病的第二大中樞神經系統(tǒng)性疾病，并且發(fā)病率逐年上升。有研究顯示氯化鋰-匹魯卡品所構建的癲癇動物模型與人類高度相似，具有類似的神經元細胞凋亡、損傷、丟失，膠質細胞的激活、增生等病理改變[9-10]，因此本研究參考相關文獻使用33只SD大鼠腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品點燃制作癲癇模型，結果發(fā)現癲癇發(fā)作4級以上的大鼠有28只，3級以下的有3只，2只在造模過程中死亡，造模成功率為84.8%。同時Nissl法及TUNEL法顯示癲癇動物海馬神經元數量減少，凋亡增加，從而說明大鼠癲癇模型構建成功。

研究表明癲癇能夠造成動物腦部神經細胞數目減少、神經元凋亡、神經功能受損、學習及記憶等認知功能減退[9-10]。因此，本研究首先通過Nissl及TUNEL實驗檢測甘草酸對癲癇大鼠海馬損傷及凋亡的影響。實驗結果表明甘草酸能夠顯著的增加癲癇大鼠海馬神經元數量，減少海馬神經元凋亡，與甘草酸減輕帕金森、阿爾茲海默病引起的大鼠腦神經元凋亡結果類似[6-7]，說明甘草酸對癲癇引起的大鼠海馬神經元損傷具有一定的抑制作用。

線粒體為細胞代謝提供充足能量，而癲癇能夠引起神經細胞線粒體功能障礙，從而導致線粒體膜電位降低、細胞膜通透性增加，最終使神經元細胞凋亡[11-13]。當線粒體受到外界凋亡信號刺激后，促使線粒體中CytC釋放，CytC進入細胞質中與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)形成復合物后，激活caspase 9，caspase 9通過級聯(lián)放大反應，將凋亡信號傳遞給caspase 3，最終導致DNA斷裂，細胞凋亡[14]。另外細胞的凋亡又受凋亡蛋白調控，Bcl-2家族是其中一種，抑制凋亡蛋白Bcl-2與凋亡蛋白Bax形成復合物，阻斷凋亡信號傳遞，最后使細胞存活。研究顯示甘草酸對細胞線粒體途徑具有一定的調控作用[15]。因此本研究進一步的探討了甘草酸對線粒體途徑相關蛋白表達的影響，結果表明甘草酸能顯著提高線粒體膜電位，降低caspase 3、9活性，上調Bcl-2及線粒體中CytC表達，下調Bax、細胞質中CytC及Apaf-1表達，最終抑制癲癇引起的大鼠海馬神經元凋亡，為甘草酸在癲癇的臨床應用提供了理論依據。