溫麗娜，郭楊志，仝永娟，李　莎

(首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院，北京　100038)

肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內癌癥相關死亡疾病中位居前三位[1-2]。肝細胞癌的發(fā)展過程是一個復雜多步的病理過程，期間可以誘發(fā)局部低氧，進而刺激血管生成[3-4]。此外，DNA損傷和炎癥反應在肝癌進程中也起重要作用[5-6]。二乙基亞硝胺 (diethylnitrosamine，DEN) 可以與DNA形成烷基加成產物，誘發(fā)肝細胞染色體畸變和姐妹染色單體交換從而導致肝癌。由于DEN引起大鼠肝臟代謝的形態(tài)學、基因組、基因表達等方面的改變與人體相似，DEN誘導的原發(fā)性肝癌大鼠模型成為最為認可的實驗模型[7]。以DEN誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌，其給藥途徑包括口服給藥、灌胃給藥和腹腔注射給藥。相對而言腹腔注射誘發(fā)大鼠肝癌的周期較短。消癌平注射液是從中藥烏骨藤的干燥藤莖中提取的有效成分制劑，具有消炎、抗癌、平喘等功效，臨床主要用于原發(fā)性肝癌、胃癌、食管癌、肺癌等多種晚期惡性腫瘤以及氣管炎、支氣管哮喘的治療。目前，關于消癌平注射液的抗癌機制已有部分研究，如抗血管生成，通過抑制PI3K激酶活性抑制癌細胞增殖侵襲，通過下調MMP-9基因表達抑制卵巢癌細胞遷移，通過降低肝癌大鼠血清IL-17、IL-6、TNF-α水平，提高血清IL-2水平提高免疫功能等[8-11]，但是消癌平注射液在低氧環(huán)境中的抗癌機制尚未明確。本研究改進DEN刺激劑量及時間，以間斷性腹腔注射DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型，探討消癌平注射液對此肝癌模型大鼠肝組織損傷的影響。腫瘤發(fā)生時常常伴隨局部低氧。在低氧環(huán)境中，消癌平注射液在體外對肝癌細胞遷移有何作用，其作用機制是否與消癌平注射液調控免疫炎性因子密切相關，本文將進一步深入研究。

1　材料和方法

1.1　細胞及實驗動物

SMMC-7721細胞株和HepG2細胞株購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫，保存于本實驗室液氮中。SPF級雄性SD大鼠60只，體重130～150 g，5周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2012-0001]。動物實驗已通過首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院實驗動物倫理與管理委員會審批。大鼠每籠4只，于首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院實驗動物中心SPF級層流室[SYXK(京)2013-0003]飼養(yǎng)，相對濕度40%～60%，12 h明暗交替進行，自由飲食飲水，定期更換墊料，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2　主要試劑及儀器

消癌平注射液(Xiao Aiping injection)購自南京圣和藥業(yè)有限公司，批號：201312261；二乙基亞硝胺(diethylnirtosamine，DEN)、CoCl2·6H2O購自美國Sigma公司；0.9%生理鹽水購自華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；4%多聚甲醛購自北京雷根生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗(青霉素-鏈霉素混合液)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶、TRIZOL購自美國Thermo公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Sciencell公司；引物購自北京三博遠志生物技術有限責任公司；cDNA逆轉錄試劑盒SuperRT cDNA Synthesis Kit及熒光定量UltraSYBR Mixture (Low ROX)購自康為世紀生物科技有限公司；蘇木精-伊紅染色液購自谷歌生物科技有限公司。BSA224S型電子分析天平購自德國賽多利斯公司；YXQ-LS-50SII型高壓蒸汽滅菌器購自上海博迅實業(yè)有限公司；BY400C型醫(yī)用離心機購自北京白洋醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；Elipse TS100型倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；Elipse E200型正置顯微鏡購自日本Nikon公司；QuantStudioTM6 Flex熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司；KD-2258型石蠟切片機、KD-BMII型冷凍包埋機、KD-P型攤片機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司。

1.3　實驗方法

1.3.1肝癌大鼠模型的建立及分組給藥

60只SD大鼠隨機分為正常對照組12只，模型組48只，模型組以50 mg/kg DEN腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周，第5周開始改為每周腹腔注射一次，連續(xù)10周；正常對照組以生理鹽水腹腔注射，每次0.1 mL，每周2次，連續(xù)4周，第5周開始改為每周腹腔注射一次，每次0.1 mL，連續(xù)10周。從第15周開始，將模型組大鼠隨機分為三組，即消癌平注射液低劑量組，消癌平注射液高劑量組，無藥物干預的模型組。消癌平注射液低劑量組給予消癌平注射液0.25 mL/100 g腹腔注射，消癌平注射液高劑量組給予消癌平注射液0.5 mL/100 g腹腔注射，正常對照組和模型組給予生理鹽水0.5 mL/100 g腹腔注射，每天一次，每周5 d，連續(xù)4周。期間注意觀察大鼠的飲食情況、皮毛變化及精神狀態(tài)。

1.3.2標本采集和處理

第19周，處死大鼠，稱量體重，取出肝臟，稱重，比較正常組、模型組、消癌平注射液干預組大鼠肝臟表面色澤、質地、結節(jié)形成情況等指標。取病變組織于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、透蠟處理后，進行石蠟包埋，制作石蠟切片，厚度5 μm，HE染色后封片，于正置顯微鏡下觀察各組肝臟組織變化或病理損傷情況。

1.3.3細胞劃痕愈合實驗

復蘇SMMC7721細胞和HepG2細胞，接種于六孔板中，分別采用RPMI 1640加10% FBS加1%雙抗培養(yǎng)基和高糖DMEM加10% FBS加1%雙抗培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待密度接近90%時，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用200 μL槍頭垂直板底劃痕，PBS洗滌3次，加入含CoCl2·6H2O 100 μmol/L的無血清培養(yǎng)基，同時加入消癌平注射液，使其終濃度分別為0、100 μL/mL，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于消癌平注射液干預0 h和24 h時拍照。采用Image J軟件分析劃痕愈合面積，依據(jù)如下公式計算劃痕愈合率：

1.3.4Real-time PCR檢測肝癌細胞IL-6 mRNA的表達

將SMMC7721細胞和HepG2細胞分別采用RPMI1640加10%FBS加1%雙抗培養(yǎng)基和高糖DMEM加10% FBS加1%雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)于六孔板中，待密度接近90%時，加入含CoCl2·6H2O 100 μmol/L的培養(yǎng)基，同時加入消癌平注射液，使其終濃度分別為0、100 μL/mL，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，加入TRIZOL，提取RNA，采用SuperRT cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉錄為cDNA，采用UltraSYBR Mixture (Low ROX)熒光定量試劑及QuantStudioTM6 Flex熒光定量PCR系統(tǒng)檢測腫瘤細胞被消癌平注射液干預前后IL-6 mRNA的表達。引物序列：IL-6：Forward：5’-AACCTGAA CCTTCCAAAGATGG-3’，Reverse：5-TCTGGCTTGTTCCTCACTACT-3’；GAPDH：Forward：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，Reverse 5’-GAAGATGGTGATGGGA TT TC-3’。

1.4　統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1　消癌平注射液對大鼠一般狀況的影響

實驗期間，正常對照組大鼠未見異常生理表現(xiàn)，無自然死亡，解剖后肝臟表面未見病理改變。模型組大鼠截止第14周DEN干預結束，死亡15只，死亡率31.25%(15/48)。模型組剩余大鼠至第18周結束，未見自然死亡。體重與正常對照組大鼠相比，顯著減輕。解剖后，模型組大鼠肝臟顏色紫暗，表面粗糙，可見不同程度的結節(jié)。消癌平注射液干預組大鼠體重與模型組相比有所增加，與正常對照組相比明顯減少，解剖后肝組織損傷與模型組相比有所減輕，高劑量作用更明顯。

2.2　消癌平注射液對肝癌大鼠病理學改變的影響

肝臟大體改變：正常對照組大鼠肝臟色澤明亮，表面紅潤無斑點，光滑無結節(jié)，如圖1A所示。模型組大鼠肝臟腫大，表面粗糙，呈現(xiàn)多個暗黃色類圓形結節(jié)，大小不一，表明形成明顯肝癌病灶，如圖1B所示。消癌平注射液低劑量組肝臟仍腫大，色澤暗淡，表面粗糙，呈現(xiàn)大小不一的類圓形淡黃色結節(jié)，如圖1C所示。消癌平注射液高劑量組肝臟腫脹程度略有減輕，表面粗糙色澤暗淡，散在大小不一的類圓形結節(jié)，其大小略小于消癌平注射液低劑量組，如圖1D所示。

注：(A)正常對照組；(B)模型組；(C)消癌平注射液低劑量組；(D)消癌平注射液高劑量組。圖1　肝臟表面變化情況Note.(A) Blank control group. (B) Model group. (C) Xiao Aiping injection low dose group. (D) Xiao Aiping injection high dose group.Fig.1　Macroscopic changes visible on the rat liver surfaces

肝臟組織學改變：對各組大鼠肝組織進行HE染色，在光鏡下觀察組織學改變。結果表明正常對照組大鼠肝細胞排列整齊，大小均一，細胞核清晰可見，無炎性細胞浸潤，如圖2A所示。模型組大鼠肝細胞排列不規(guī)則，細胞膜不規(guī)則，細胞核異常增大裸露，可見多核性，核深染，密度增加，細胞質呈顆粒狀具有空泡，一般具有高核質比(細胞核/細胞質)，肝細胞明顯發(fā)育不良，形成肝細胞癌病理特征，如圖2B所示；消癌平注射液低劑量組與模型組相比肝細胞排列仍不規(guī)則，細胞核深染及密集程度有所減輕，如圖2C所示；消癌平高劑量組與低劑量組相比肝細胞排列略規(guī)則，核深染及密集程度進一步減輕，如圖2D所示。

注：(A)正常對照組；(B)模型組；(C)消癌平注射液低劑量組；(D)消癌平注射液高劑量組。圖2　肝組織病理改變的HE染色圖(×100)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Xiao Aiping injection low dose group. (D) Xiao Aiping injection high dose group.Fig.2　Pathological changes of the rat liver tissues. HE staining

2.3　消癌平注射液對低氧環(huán)境下肝癌細胞遷移能力的影響

如圖3 A、B所示，在CoCl2·6H2O引起的化學低氧環(huán)境下，SMMC-7721細胞正常對照組和消癌平注射液干預組在劃痕后0 h無明顯差異；劃痕后24 h，100 μL/mL消癌平注射液組與正常對照組相比，劃痕愈合程度減小，其愈合率分別為(63.20±3.00)% 和 (38.83±2.00)%，P<0.01，t=10.88，表明消癌平注射液能夠抑制SMMC-7721細胞的劃痕愈合。

如圖4A、B所示，同樣在CoCl2·6H2O引起的化學低氧環(huán)境下，劃痕后24 h，HepG2細胞正常對照組劃痕明顯愈合，100 μL/mL的消癌平注射液干預組的劃痕愈合程度明顯減小，其劃痕愈合率分別為(70.17±3.00)% 和 (12.06±2.00)%，P<0.01，t=29.289，表明消癌平注射液能夠顯著抑制HepG2細胞的劃痕愈合。圖3、圖4對比可以看出，消癌平注射液對HepG2細胞劃痕愈合的抑制作用更顯著。

注：(A)干預24 h消癌平注射液對SMMC-7721細胞劃痕愈合的影響;(B)干預24 h SMMC-7721細胞劃痕愈合的百分比；與正常對照組相比，*P< 0.01。圖3　消癌平注射液對SMMC-7721細胞遷移的影響Note. (A) After intervention for 24 h, effect of Xiao Aiping injection on the wound healing ability of SMMC-7721. Cells. (B) After intervention for 24 h, wound healing percentages of the blank control group and Xiao Aiping treatment group of SMMC-7721 cells. Compared with the NC group，*P< 0.01.Fig.3　Effect of Xiao Aiping injection on the migration of SMMC-7721 cells

注：(A)干預24 h消癌平注射液對HepG2細胞劃痕愈合的影響；(B)干預24 h HepG2細胞劃痕愈合的百分比。與正常對照組相比，*P< 0.01。圖4　消癌平注射液對HepG2細胞遷移的影響Note.(A) After intervention for 24 h, effect of Xiao Aiping injection on the healing ability of HepG2 cells. (B) After inntervention for 24 h, the healing percentage of blank control group and Xiao Aiping injection group of HepG2 cells. Compared with the NC group,*P< 0.01.Fig.4　Effect of Xiao Aiping injection on the migration of HepG2 cells

2.4　消癌平注射液對低氧環(huán)境下肝癌細胞IL-6 mRNA表達的影響

如圖5所示，在CoCl2·6H2O模擬的化學低氧環(huán)境下，100 μL/mL的消癌平注射液作用24 h后，可以抑制HepG2細胞IL-6 mRNA的表達，與正常對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。對于SMMC-7721細胞，消癌平注射液具有抑制其IL-6 mRNA表達的作用趨勢，但是與正常對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。這與消癌平注射液干預組對HepG2和SMMC-7721細胞劃痕愈合抑制作用趨勢一致。

注：與正常對照組相比，*P<0.05。圖5　消癌平注射液對SMMC-7721和HepG2細胞IL-6 mRNA表達的影響Note. Compared with the NC group,*P<0.05.Fig.5　Effect of Xiao Aiping injection on the expression of IL-6 mRNA of SMMC-7721and HepG2 cells

3　討論

本研究證實不同劑量的消癌平注射液可以不同程度地減輕間斷性腹腔注射DEN的改良誘導方案成功復制的肝癌模型大鼠肝臟的病理損傷。在CoCl2誘發(fā)的化學低氧條件下，消癌平注射液能夠不同程度地抑制肝癌細胞SMMC-7721和HepG2細胞的遷移，其作用程度與消癌平注射液在低氧條件下抑制SMMC-7721和HepG2細胞IL-6 mRNA表達的作用程度正向相關，但是消癌平注射液抑制SMMC-7721細胞IL-6 mRNA表達的作用與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，僅對HepG2細胞IL-6 mRNA表達的抑制作用與正常對照組相比差異有顯著性，說明抑制IL-6 mRNA表達可能只是消癌平注射液在低氧環(huán)境中抑制肝癌細胞遷移的作用機制之一。

將DEN溶解于飲用水中飼養(yǎng)大鼠或每日灌胃給予DEN誘發(fā)大鼠肝癌是最常見的造模方法。但是這兩種方法均需每日給予DEN，操作繁瑣，致癌周期相對也較長。每周定期腹腔注射DEN誘發(fā)肝癌，既可減少操作，又可增加肝細胞損傷恢復期，降低大鼠死亡率[12]。本研究采用前4周每周腹腔注射2次DEN 50 mg/kg體重，后10周每周腹腔注射1次DEN 50 mg/kg體重的改良方案誘發(fā)大鼠肝癌，進而研究消癌平注射液對此模型的作用，研究結果與文獻報道的消癌平注射液具有減輕灌胃給予DEN誘發(fā)的原發(fā)性肝癌大鼠肝組織病理損傷作用的研究結果一致[11]。

研究表明消癌平注射液可減輕原發(fā)性肝癌模型大鼠肝功能的損傷，提高腫瘤個體的免疫功能[11]。但是在腫瘤微環(huán)境中消癌平注射液是否通過調控免疫炎性因子抑制肝癌的侵襲轉移尚未明確。低氧作為腫瘤微環(huán)境的常見現(xiàn)象，在各類腫瘤的侵襲和轉移中發(fā)揮著重要的作用。低氧微環(huán)境可以顯著促進乳腺癌的侵襲和轉移已被報道，其作用機制錯綜復雜[14]。因此，在低氧環(huán)境下研究藥物對腫瘤細胞遷移能力的影響，更有利于模擬患者體內環(huán)境的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。免疫炎性細胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成成員之一。IL-6作為免疫炎性細胞釋放的重要促炎因子，具有調節(jié)細胞增殖、存活和遷移等多種功能。IL-6的高表達已經(jīng)成為乳腺癌、前列腺癌和頭頸癌復發(fā)、轉移和低存活率的獨立預測指標[15-17]。IL-6可以通過多種信號通路促進腫瘤進程[18-20]，其表達水平與肝癌化療藥物抵抗密切相關[21]。既往研究表明消癌平注射液可以下調肝癌大鼠血清IL-6水平，本研究證實消癌平注射液可在低氧條件下抑制肝癌細胞的遷移，并抑制HepG2細胞IL-6 mRNA的表達。除IL-6之外，消癌平注射液在復雜的腫瘤微環(huán)境中抑制肝癌細胞遷移的作用機制是否還與其它免疫炎性因子相關，還有待于進一步研究。

參考文獻：