張曉文，張慧云,2，王 維，湛萌萌，何韶衡

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心，遼寧錦州 121001；2. 蘇州市相城人民醫(yī)院中心實驗室，江蘇蘇州 215100)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是由過敏原引起的鼻部炎癥性疾病[1]，主要癥狀是鼻塞、鼻腔分泌物增多、鼻腔瘙癢。目前認為遺傳和環(huán)境如過敏原均參與AR發(fā)病[2]。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是表達于不同細胞的模式識別受體家族，在過敏性疾病中起重要作用[3]。病原微生物及其產(chǎn)物和內(nèi)源性刺激均可通過TLR依賴途徑激活靶細胞，引起或加重過敏反應(yīng)[4]。

TLR2在識別革蘭氏陰性細菌中起重要作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)過敏患者TLR2 mRNA水平升高[5]，提示TLR2可能參與過敏反應(yīng)。TLR4可識別脂多糖(LPS)，TLR4激活后可產(chǎn)生針對入侵病原微生物免疫應(yīng)答。研究報道，過敏性哮喘和AR患者TLR4表達升高[6]，提示TLR4可能參與氣道炎癥性疾病。呼吸道的炎癥細胞如嗜酸性粒細胞和結(jié)構(gòu)細胞均表達TLR7。動物模型實驗證明TLR7激動劑可控制過敏性哮喘[7]，TLR9大量表達于AR患者鼻黏膜上皮細胞和骨髓白細胞[8]，提示TLR7和TLR9可能參與過敏性氣道炎癥。

嗜酸性粒細胞參與AR等氣道過敏性疾病[9]。然而，目前人們對AR患者血液嗜酸性粒細胞TLRs的表達，尤其是過敏原對嗜酸性粒細胞上TLRs表達的影響還知之甚少。本研究旨在用流式細胞儀技術(shù)檢測TLR2、TLR4、TLR7和TLR9在AR患者嗜酸性粒細胞群中的表達情況，并分析其相關(guān)性，以期為AR的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1實驗試劑購自Biolegend(San Diego, CA, USA)的試劑：APC/Cy7耦合的小鼠抗人CCR3、APC耦合的鼠抗人TLR4、APC耦合的小鼠IgG1、BV421耦合的小鼠IgG1、Zombie Aqua Fixable Viability kit(死細胞去除染料)、FcR阻斷劑、紅細胞裂解液；購自R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)的試劑：PE耦合的小鼠抗人TLR7、PE耦合的小鼠IgG2A；購自Santa Cruz(Delaware Ave Santa Cruz, CA, USA)的試劑：FITC耦合小鼠抗人TLR9、FITC耦合的小鼠 IgG2A；購自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)公司的試劑：BV421耦合的小鼠抗人TLR2。蒿草花粉過敏原提取液、塵螨提取液和梧桐花粉過敏原提取液購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司(中國)；PBS緩沖液購自Solarbio(北京，中國)；Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒購自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)；皮膚點刺試驗過敏原購自ALK-ABELLO(Denmark)；其他常用的化學(xué)試劑如鹽和緩沖液均為分析級純度。低溫高速離心機(Thermo Scientific, USA)，水浴鍋(精宏，中國)，F(xiàn)ACSVerse流式細胞儀(BD Biosciences, USA)。

1.2研究對象共募集了40位志愿者，其中24例AR患者(AR病例組)和16例健康人(正常對照組)，其一般資料見表1，組間在年齡、性別構(gòu)成上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗AR的診斷標準符合2015年美國耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會專家組發(fā)布的AR臨床實踐指南[10]；所有AR患者均處于急性發(fā)作期，且至少2周前停止服用抗鼻炎治療的藥物，所有志愿者至少1月內(nèi)未發(fā)生過呼吸道感染。本臨床研究獲得了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準，并與每位志愿者均簽訂了知情同意書。

表1 志愿者的一般資料Tab.1 General information of the volunteers

1.3血液樣本的采集對募集的AR急性發(fā)作期入院患者和門診正常人的志愿者分別采集病史資料；均進行皮膚點刺試驗，點刺試驗陽性的AR患者和點刺試驗陰性的正常人為本研究的研究對象，即AR病例組和正常對照組。每位志愿者均采集1 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

1.4流式細胞術(shù)檢測血液嗜酸性粒細胞富集群TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的表達全血在無菌環(huán)境下分別加入塵螨、蒿草花粉和梧桐花粉過敏原提取液(質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL)，37 ℃水浴震蕩孵育1 h；1 200 r/min 離心6 min后棄去上清，加入死細胞去除染料和FcR阻斷劑，均勻混合后，避光孵育15 min，然后加入抗CCR3、TLR2和TLR4抗體，避光孵育15 min后加入紅細胞裂解液，避光孵育12 min，離心棄上清后加入1 mL的PBS，1 200 r/min離心6 min，棄上清，用固定/透膜液固定細胞，透膜洗液清洗后加入抗TLR7和TLR9抗體孵育，再用PBS清洗，最后用流式細胞儀檢測TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的表達。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，多組間比較采用秩和檢驗，組間差距有統(tǒng)計學(xué)意義時用Mann-WhitneyU進一步做比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1蒿草花粉過敏原誘導(dǎo)AR嗜酸性粒細胞富集群TLR2+細胞比例升高流式細胞術(shù)檢測嗜酸性粒細胞富集群(設(shè)門方法見圖1)中TLR2的表達變化，結(jié)果顯示，AR患者血液經(jīng)蒿草花粉刺激后，嗜酸性粒細胞富集群中TLR2+細胞的比例升高了約7%(P<0.05)，梧桐花粉和塵螨過敏原提取液對TLR2的表達影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。3種過敏原對正常對照組TLR2表達影響無統(tǒng)計學(xué)意義；對AR病例組患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細胞富集群TLR2+細胞比例與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 嗜酸性粒細胞富集群的設(shè)門方法Fig.1 Gating strategies for eosinophil-enriched cells

2.2AR患者嗜酸性粒細胞富集群中TLR4表達增強流式細胞術(shù)檢測AR患者組和正常對照組外周血的嗜酸性粒細胞富集群中TLR4(圖3A、B)的表達，結(jié)果顯示，AR患者嗜酸性粒細胞富集群中TLR4+細胞的MFI與健康對照組相比升高20%(P<0.05)。梧桐花粉、蒿草花粉和塵螨過敏原提取液對健康人和AR患者血液嗜酸性粒細胞TLR4表達影響很小(P>0.05)。

圖3 人外周血嗜酸性粒細胞富集群中TLR4細胞MFI的流式細胞儀檢測結(jié)果(A)及表達變化分析(B)Fig.3 Representative flow cytometric graphs (A) of MFI of TLR4 in eosinophil-enriched cells from human blood and expressions by MFI analysis (B)

2.3AR患者嗜酸性粒細胞富集群中TLR7+細胞比例增多用流式細胞術(shù)檢測AR患者和正常人群血液嗜酸性粒細胞富集群TLR7+和TLR9+的細胞比例，結(jié)果顯示，與健康人相比，AR患者嗜酸性粒細胞富集群中TLR7+細胞的比例升高4.8倍(圖4A、B)，TLR7+嗜酸性粒細胞的MFI升高46%(圖4C、D，P<0.05)；而TLR9在正常人和AR患者血液嗜酸性粒細胞的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 人外周血嗜酸性粒細胞富集群中TLR7+細胞表達的流式細胞儀檢測結(jié)果(A)和百分比分析(B)、MFI代表圖(C)及表達變化的比較(D)Fig.4 Representative flow cytometric graphs (A) of TLR7+ expression in eosinophil-enriched cells from human blood and percentage analysis (B), MFI of TLR7 (C) and MFI analysis of the expression (D)

2.4嗜酸性粒細胞群TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的表達中度相關(guān)靜息狀態(tài)下，AR患者嗜酸性粒細胞富集群中TLR2和TLR7表達增強，蒿草花粉過敏原誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞富集群TLR2表達升高，提示TLR2、TLR4、TLR7和TLR9之間有潛在關(guān)系。進一步對其細胞表達水平進行了相關(guān)性分析，Pearson檢驗結(jié)果顯示(表2)，AR患者嗜酸性粒細胞群中TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的嗜酸性粒細胞均呈中度相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.670，P<0.01；r=-0.430，P<0.05；r=0.446，P<0.05)。

表2 AR患者TLR2+、TLR4+、TLR7+和TLR9+嗜酸性粒細胞的相關(guān)性Tab.2 Correlations between TLR2+, TLR4+ ,TLR7+ and TLR9+ eosinophils

3 討 論

螨蟲和植物花粉如艾蒿花粉、梧桐花粉是室內(nèi)、外過敏原的重要來源，通過與過敏反應(yīng)效應(yīng)細胞如嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞表面的IgE-FcεRI復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)可誘導(dǎo)AR等過敏性疾病的發(fā)生[11-12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)參與各種抗原免疫應(yīng)答的TLR也可誘導(dǎo)AR發(fā)病[13-14]。

TLR2配體可以抑制肥大細胞脫顆粒[15]，提示TLR2可能有抑制過敏反應(yīng)的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細胞富集群TLR2+細胞的比例降低，提示進一步證實TLR2可抑制AR發(fā)病；而經(jīng)蒿草花粉過敏原刺激后，AR患者血液嗜酸性粒細胞富集群中TLR2升高約7%，提示過敏原中的某種蛋白成分可能誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞表達TLR2，但其具體機制尚需進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)TLR4在AR患者中表達水平升高[6]，提示TLR4可能參與AR。本研究發(fā)現(xiàn)AR患者嗜酸性粒細胞富集群中TLR4+細胞的MFI升高20%(P<0.05)，進一步提示TLR4參與AR發(fā)病。

有報道稱TLR7激活嗜酸性粒細胞與患者的過敏狀態(tài)有關(guān)[16]。此外，研究發(fā)現(xiàn)TLR7廣泛參與氣道過敏性疾病[7,16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，AR患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細胞富集群中TLR7+細胞的比例升高4.8倍。由于TLR7激動劑可控制過敏性哮喘[7]，本研究結(jié)果提示AR可能通過反饋機制誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞表達TLR7，AR發(fā)病可能與其他細胞TLR7表達減少有關(guān)。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)AR患者和健康人血液嗜酸性粒細胞TLR9的差異性表達，但并不排除其他細胞通過TLR9影響過敏性炎癥發(fā)生的可能。

TLRs通過與其配體相互作用，激活免疫細胞和結(jié)構(gòu)細胞而發(fā)揮天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TLRs(TLR3除外)與其配體交聯(lián)可誘導(dǎo)MyD88募集至TLRs上的TIR結(jié)構(gòu)域[19-20]，提示TLRs之間可能存在某種聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)AR患者嗜酸性粒細胞群中TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的嗜酸性粒細胞均呈中度相關(guān)，提示TLRs可能通過誘導(dǎo)其他TLRs的表達而參與AR?？傊?，嗜酸性粒細胞源的TLR2、TLR4和TLR7可能在AR中起重要作用，TLR2、TLR4和TLR7可能是治療AR的潛在靶點。

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