郭奕瓊，趙琳琳，姚澤偉，蔣 璇，張亞楠，翟仙敦

死亡時間(postmortem interval,PMI)，尤其是高度腐敗尸體的死亡時間推斷一直是現(xiàn)階段法醫(yī)偵破案件中的一大難題。嗜尸性蠅類在人死后很快即可到達(dá)尸體，并在其上產(chǎn)卵、孵化、成蛹、破殼發(fā)育到成蟲，并逐漸演替成為群落直至白骨化，根據(jù)嗜尸性蠅類的生長發(fā)育規(guī)律和群落演替規(guī)律可以為死亡時間推斷提供依據(jù)。因此，利用嗜尸性昆蟲進(jìn)行PMI推斷是法醫(yī)學(xué)重要的研究方向之一[1-5]。傳統(tǒng)的嗜尸性蠅類形態(tài)學(xué)鑒定對鑒定人員經(jīng)驗依賴性很高，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蠅類分子鑒定顯示了無可比擬的優(yōu)勢，其中DNA的提取是關(guān)鍵限速步驟[1]。本實驗通過對Chelex-100法、試劑盒法、酚—氯仿法3種方法的不同部位提取效果的比較，旨在尋找一種操作簡單、成本低、對蠅類完整形態(tài)破壞小、常規(guī)分子生物學(xué)實驗室即可完成，并且可以滿足實踐需要的嗜尸性蠅類DNA提取方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1嗜尸性蠅類樣本豬肝誘捕并采集河南科技大學(xué)食堂排污管下大頭金蠅，室溫晾干，并選取體積大小相似的樣本24只。每種方法隨機選取8只樣本，每個樣本分別提取頭、胸肌、足、翅4部分，足和翅選取單側(cè)同側(cè)組織，在去離子水中清洗后吸水紙吸干，置于離心管中，用眼科剪剪碎。

1.1.2主要試劑和儀器蛋白酶K、TaKaRa?Mini BEST提取試劑盒、擴增試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，Chelex-100(美國伯樂公司)，氯仿、異戊醇、無水乙醇、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(天津永大化學(xué)試劑有限公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，Tris-HCl(BIOSHARP公司)，Tris-平衡酚(北京索萊寶科技有限公司)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，F(xiàn)LA6000型微量紫外分光光度計(杭州晶飛科技有限公司)，9700 PCR儀(美國ABI公司)，一體式核酸電泳儀(英國Cleaver公司)。

1.2方法

1.2.1酚—氯仿法參照文獻(xiàn)[1,6-10]的提取方法，部分步驟改動。將剪碎的組織置于1.5 mL離心管中，加入400 μL 1×TNE，1/10體積的10% SDS(約40 μL，終濃度為1%)、1/100體積(10 mg·mL-1)PK(約4 μL，終濃度為100 μg·mL-1)，混勻。56 ℃水浴2～3 h后加入12 μL PK，然后過夜水浴消化。加入等體積(約500 μL)酚/氯仿/異戊醇(V/V/V =25∶24∶1)，以上下顛倒離心管方式混勻液體5 min，至管內(nèi)液體混合成乳狀液，5 000 r·min-1，離心5 min。吸取上層水溶液轉(zhuǎn)移至新管，重復(fù)上一步兩遍，直至水相和有機相之間看不到蛋白質(zhì)為止(胸肌樣本重復(fù)3遍)。吸取上層水溶液轉(zhuǎn)移至新管，加入等體積(約420 μL)氯仿，倒轉(zhuǎn)混勻5 min，5 000 r·min-1，離心5 min。吸取上層水溶液轉(zhuǎn)移至新管，加入2倍體積(約900 μL)的預(yù)冷無水乙醇(-20 ℃)，輕柔顛倒混勻，沉淀出DNA，低溫離心4 ℃ 12 000 r·min-1，離心15 min，棄上清。加入70%預(yù)冷乙醇1.5 mL，混勻，低溫離心4 ℃ 12 000 r·min-1，離心5 min，棄上清。重復(fù)此步驟2～3次，室內(nèi)自然晾干，加150 μL去離子水溶解DNA，4 ℃保存。

1.2.2Chelex-100法參照尹曉宏等[2]的提取方法，部分步驟改動。將剪碎的組織置于0.6 mL離心管中，加入5% Chelex-100 200 μL，PK(10 mg·mL-1)2 μL(終濃度100 μg·mL-1)56 ℃水浴2～3 h后，觀察上清液澄清透明度，再加入PK(10 mg·mL-1)8 μL，過夜消化。100 ℃水浴15 min，取出后高速渦輪振蕩5～10 s。低溫離心4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，4 ℃保存。

1.2.3試劑盒法將剪碎的組織置于1.5 mL離心管中，使用TaKaRa?Mini BEST試劑盒，參照說明書提取DNA。

1.3DNA質(zhì)量濃度和純度檢測

1.3.1微量紫外分光光度計法使用微量紫外可見分光光度計測定DNA樣品的D260、D280，并計算D260/D280比值。

1.3.2凝膠電泳檢測0.8%瓊脂糖凝膠，溴化乙錠染色，DNA樣品5 μL混合1 μL上樣緩沖液，120 V電泳60 min，置于凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.3.3PCR擴增及電泳檢測參照文獻(xiàn)[11-14]改動部分步驟。擴增細(xì)胞核28S rRNA基因中長度約750 bp(F：5’-GACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3’；R：5’-GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAG-3’)。總反應(yīng)體系10 μL，含2×TaKaRa?premix 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2～0.4 μL，DNA模板0.2～1.2 μL，ddH2O補足體系。PCR擴增反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃1 min 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共5次循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 1 min，共35次循環(huán)；72 ℃延伸8 min。擴增產(chǎn)物4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，35 min)，溴化乙錠染色，電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

2 結(jié)果

2.1DNA濃度和純度檢測結(jié)果酚—氯仿法頭和胸肌D260/D280值位于1.87～2.08之間，足和翅分別位于1.24～1.84和1.09～1.70之間，其中足有兩個樣本值是2.15、2.47；Chelex-100法D260/D280值多小于1.62；試劑盒法D260/D280值頭位于1.52～1.81之間，胸肌、足、翅分別位于2.98～7.63、2.86～5.84和4.08～6.60之間，其中足有1個樣本值是1.41，見表1。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方法檢驗發(fā)現(xiàn)，D260/D280比值3種方法存在差異(P=0.000)，說明3種不同的方法提取的DNA純度存在差異；不同部位之間存在差異(P=0.001)，說明不同部位提取的DNA純度存在差異；方法和部位之間存在交互作用(P=0.000)，說明不同的方法對應(yīng)不同的提取部位會有不同的DNA純度。DNA濃度3種方法之間存在差異(P=0.000)，說明3種不同的方法提取的DNA濃度存在差異；不同部位之間存在差異(P=0.000)，說明不同部位提取的DNA濃度存在差異；方法和部位之間存在交互作用(P=0.000)，說明不同的方法對應(yīng)不同的提取部位會有不同的DNA濃度。

表1 3種方法提取大頭金蠅不同部位DNA純度和濃度值

注：不同方法、不同部位提取的DNA純度和濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。(P<0.05)。

2.2電泳檢測結(jié)果酚—氯仿法和試劑盒法頭和胸肌均有明顯條帶，足條帶相對較弱，片段長度>10 kb，但酚—氯仿法有拖尾現(xiàn)象。翅幾乎看不到條帶。Chelex-100法4個部位均未看到明顯條帶，見圖1。

泳道1：1 kb DNA ladder；2：100 bp DNA ladder；3～10：酚—氯仿法；11～18：Chelex-100法；19～26：試劑盒法。圖1 大頭金蠅不同部位3種方法提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果3種方法4個部位提取的DNA均成功擴增出約750 bp的目的產(chǎn)物(圖2)，包括圖1中不能看到條帶的樣本。試劑盒法的頭，胸肌，足3個部位，酚—氯仿法和Chelex-100法的足擴增效果均很好，酚—氯仿法和Chelex-100法頭和胸肌的模板DNA均經(jīng)過不同程度的稀釋，并調(diào)整引物濃度后成功擴增。3種方法提取的翅DNA增加模板量后擴增效果明顯變好(圖2中未列出)。

泳道1：100 bp DNA ladder；2～9：酚—氯仿法；10～17：Chelex-100法；18～25：試劑盒法。圖2 大頭金蠅不同部位3種方法提取DNA的擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

DNA提取是嗜尸性蠅類分子鑒定中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其提取方法和提取后的DNA質(zhì)量直接影響后續(xù)的檢測。本實驗3種方法均能提取并擴增成功，其中酚—氯仿法操作步驟多、過程繁瑣，并且經(jīng)過多次轉(zhuǎn)移后DNA損耗相對較大，但是提取的DNA樣品純度最高，濃度也較高，因此雖然酚—氯仿法操作繁瑣，但依舊是研究人員最常采用的常規(guī)方法；Chelex-100法操作簡便，試劑安全無毒，單管操作DNA損失小，其提取的DNA樣品濃度最高，例如尹曉宏等[2]通過對比并改良了Chelex-100法后得出其優(yōu)點，但蛋白質(zhì)污染嚴(yán)重，樣品純度不高，并且Chelex-100法在提取過程中使雙鏈DNA變性成單鏈，因此Chelex-100法提取的DNA只適用于進(jìn)行基于PCR的分析；試劑盒法成本相對較高，提取的DNA濃度較低，但是其PCR擴增效果最佳。對大頭金蠅軀體4部分DNA提取分析發(fā)現(xiàn)，頭和胸肌提取的DNA濃度最高，這也在其他文獻(xiàn)中得到證明[1]，但是采用這兩個部位對蠅類形態(tài)完整性破壞太大，并且胸肌腐敗時檢材很難提取。足和翅分別對稱分布，雙側(cè)均有，提取一側(cè)組織后仍可保留較完整的形態(tài)特征，但翅檢材量較少且易丟失，提取的DNA濃度較低，對后續(xù)研究來說存在較大風(fēng)險，因此作者認(rèn)為蠅類的足是提取DNA的最佳檢材。

在DNA質(zhì)量檢測方面(表1)，利用微量紫外分光光度計對其進(jìn)行檢測，通過計算D260/D280的比值判斷DNA純度。一般認(rèn)為D260/D280在1.8～1.9時純度較高，>1.9時有RNA污染，<1.6時有蛋白質(zhì)或酚污染。但在實際操作中，并不能只根據(jù)這些數(shù)據(jù)判斷是否提取成功，而應(yīng)該同時結(jié)合電泳和擴增結(jié)果。比如，此次實驗中，試劑盒法所提取的DNA樣品在紫外分光光度計定量測量時，其數(shù)據(jù)并不理想，整體數(shù)值大部分偏高，可能是由于提取的樣本中RNA 含量過高所導(dǎo)致的，但是在電泳和擴增結(jié)果中，試劑盒法的結(jié)果較為理想(圖1-2)，提取產(chǎn)物和擴增產(chǎn)物電泳時均出現(xiàn)明亮清晰的條帶。在實驗中，作者還嘗試Chelex-100法提取DNA時加入DTT(二硫蘇糖醇)改良實驗效果[15-16]，分別選用同一樣本的對側(cè)足和翅在消化時加入DTT與未加DTT的樣品進(jìn)行對比，結(jié)果表明加入DTT對Chelex-100法所提取的DNA濃度有所提高，這可能與足和翅的組織成分有關(guān)，但是這需要更多的理論支持和實驗驗證。

總體來說，通過本次研究發(fā)現(xiàn)，3種提取方法各具優(yōu)勢，針對不同的實驗需求，應(yīng)采用不同的DNA提取方法。制備高純度低成本DNA推薦使用酚—氯仿法，提取高濃度樣品推薦使用Chelex-100法，若要得到最佳的擴增效果推薦使用試劑盒法。鑒于法醫(yī)昆蟲DNA的研究一般都是基于PCR的分析，作者建議采用Chelex-100法提取單側(cè)足部DNA。

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