王 濤 鄭洪洪 徐志新

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，海南 ?？?570311)

腦缺血可導(dǎo)致氧和葡萄糖運輸障礙，造成局部組織能量代謝障礙，出現(xiàn)缺血性損傷，而在再灌注恢復(fù)血液后，其缺血性損傷會進(jìn)一步加重，這種現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷〔1，2〕。腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的過程，在腦組織缺血缺氧的基礎(chǔ)上，血液灌注后可產(chǎn)生氧化作用，生成活性氧簇及活性氮簇，進(jìn)而損傷腦細(xì)胞，破壞細(xì)胞能量代謝；同時，腦缺血再灌注還可導(dǎo)致白細(xì)胞積聚、炎性損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸釋放，這些病理變化都可以對腦組織產(chǎn)生很大的影響，其中影響最大的就是腦水腫和神經(jīng)元損傷〔3，4〕。腦缺血再灌注后對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷通常是由能量代謝障礙引起的，而受損的神經(jīng)元可在細(xì)胞間傳遞炎癥信號，放大炎癥反應(yīng)，引起單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞大量聚集，引發(fā)繼發(fā)性損傷。由此可見，在腦缺血再灌注損傷中炎癥性損傷是重要的組成部分〔5，6〕。七氟烷為含氟的吸入麻醉藥，其最小肺泡濃度(MAC)穩(wěn)定，具有起效快、蘇醒快等特點，且組織溶解性和在體內(nèi)的代謝程度均較低，不增加腦血流量〔7〕。相關(guān)研究顯示〔8〕，七氟烷預(yù)處理對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有一定的保護(hù)作用，然而關(guān)于七氟烷預(yù)處理對腦缺血再灌注引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的相關(guān)報道目前較少。本研究旨在探討七氟烷預(yù)處理對缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能及血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-1β水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取無特定病原體的Wistar雄性大鼠36只，體重180～200 g，平均(190.11±6.58)g，室溫保持20℃～25℃，濕度50%～65%，每天給予12 h光照時間，保持室內(nèi)通風(fēng)，避免噪聲，自由飲食、活動。實驗大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(10只)、模型對照組(13只)和七氟烷組(13只)。

1.2實驗方法 對照組和模型對照組大鼠吸入100%純氧，60 min后進(jìn)行后續(xù)處理。七氟烷組吸入七氟烷，濃度配比為2.5%七氟烷+97.5%氧氣，保持自主呼吸60 min后采用純氧洗脫15 min，然后進(jìn)行建模處理。建模方法〔9〕：采用烤燈維持大鼠體溫，使其體溫在建模過程中保持在37℃～38℃，采用10%水合氯醛350 mg/kg進(jìn)行麻醉，腹腔注射。大鼠仰臥位固定，常規(guī)消毒后于大鼠頸部正中作一切口，鈍性分離各層組織，暴露右側(cè)頸總動脈，分離右側(cè)頸總動脈及頸外動脈，避免損傷迷走神經(jīng)和氣管，于頸內(nèi)、頸總動脈處用動脈夾夾閉，頸外動脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎，中間剪開切口，將頸外動脈游離端拉至與頸內(nèi)動脈成一條直線，將尼龍線由頸外動脈插入，推入約18 mm，當(dāng)感受到阻力時停止推入。夾閉血管缺血2 h后將尼龍線拔出，再灌注恢復(fù)血液流通。對照組大鼠僅進(jìn)行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及插入尼龍線。建模后密切關(guān)注模型對照組和七氟烷組大鼠，采用Bederson評分評估建模情況，舍去行為完全正常的大鼠，同時舍去手術(shù)時出血較多、癥狀很重或死亡的大鼠(這部分大鼠可能會出現(xiàn)出血性腦損傷)，經(jīng)評估后模型對照組和七氟烷組均有10只大鼠符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3大鼠神經(jīng)功能檢測 再灌注24 h后，采用Garcia評分量表評估大鼠的神經(jīng)功能，該量表主要從自主活動、提尾懸空時四肢活動對稱情況、提尾至桌面邊緣時前肢伸展情況、攀爬和抓持鐵籠的能力、身體感覺反應(yīng)、兩側(cè)胡須觸覺反射情況這6個方面進(jìn)行考察，每個方面均根據(jù)情況給予0～3分，總分為18分，分?jǐn)?shù)越低說明神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。該步驟由同一名不清楚分組情況的實驗員完成，以更加客觀地進(jìn)行評判。

1.4血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平檢測 大鼠再灌注24 h時采集股動脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，提取上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平，試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。采用96孔板，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔，于每孔中分別加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μl，設(shè)立空白孔和待測樣品孔，均加入樣品稀釋液40 μl、待測樣品10 μl，晃動混勻，封膜室溫孵育30 min，倒掉液體，甩干，洗滌緩沖液清洗，甩干，除空白孔外，每孔加入對應(yīng)的酶標(biāo)試劑50 μl，封膜室溫孵育30 min，倒掉液體，甩干，洗滌緩沖液清洗，甩干，每孔均加入A、B顯色劑50 μl，晃動混勻，室溫避光孵育15 min，每孔加入終止液50 μl。采用酶標(biāo)儀(BIO-RAD 680，美國)檢測各孔位的光密度值，波長450 nm，以空白對照組校零。

1.5腦梗死面積比較 完成上述實驗后斷頭處死所有大鼠，迅速取出腦組織置于-20℃保存，10 min后取出，切除小腦、低位腦干、嗅球等部位，然后進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，將切片置于2%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，TTC染色后正常腦組織區(qū)域為紅色，腦梗死區(qū)域為白色，拍照后用圖像分析系統(tǒng)軟件計算腦梗死面積百分比。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠的神經(jīng)功能比較 三組大鼠的神經(jīng)功能評分整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=611.164，P=0.000)，七氟烷組(12.20±1.12)和模型對照組(7.10±0.53)大鼠神經(jīng)功能評分明顯低于對照組(18.00±0.00)，七氟烷組大鼠神經(jīng)功能評分明顯高于模型對照組(P<0.05)。

2.2三組血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平比較 三組血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，七氟烷組和模型對照組血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于對照組，IL-10水平明顯低于對照組(P<0.05)；七氟烷組血清TNF-α、IL-1β水平明顯低于模型對照組，IL-10水平明顯高于模型對照組(P<0.05)。見表1。

表1 三組血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型對照組比較：2)P<0.05

2.3三組大鼠腦梗死面積百分比比較 三組大鼠的腦梗死面積百分比整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12 269.165，P=0.000)，七氟烷組〔(10.14±0.22)%〕和模型對照組〔(16.21±0.34)%〕腦梗死面積百分比明顯高于對照組〔(0.00±0.00)%〕，七氟烷組大鼠腦梗死面積百分比明顯低于模型對照組(P<0.05)。

3 討 論

腦組織貯氧量低，但耗氧量占全身總耗氧量的20%左右，因此，腦組織對缺血、缺氧非常敏感，長時間的缺血可導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)不可逆損傷，盡快恢復(fù)正常的血液流通是治療腦缺血的基礎(chǔ)。然而，腦缺血再灌注可進(jìn)一步對腦組織造成傷害，增加腦缺血患者的治療難度。因此，探究腦缺血再灌注損傷的防治方案具有重要的臨床意義〔10〕。目前臨床上常用的缺血再灌注損傷的防治方案主要包括缺血預(yù)處理、缺血后處理、亞低溫療法、阻止細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、減少自由基生成、抗炎癥反應(yīng)、吸入性麻醉劑等〔11〕。吸入性麻醉劑具有安全可靠、易于控制等特點，是臨床全麻手術(shù)常用的麻醉方式。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，吸入性麻醉劑可減輕腦、腎臟、肝臟、心臟等由缺血再灌注引起的損傷。七氟烷是一種吸入性麻醉藥，相關(guān)研究結(jié)果顯示〔13〕，七氟烷可降低腦缺血再灌注模型大鼠血清中的炎癥因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到腦保護(hù)作用。

腦缺血發(fā)生后活性氧簇及活性氮簇含量增加，二者可相互作用形成過氧亞硝酸鹽，進(jìn)而對神經(jīng)元造成損傷。同時，腦缺血再灌注后的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧化應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝障礙等可促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過度開放，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)滲透壓明顯上升，出現(xiàn)線粒體腫脹、外膜破裂，細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-3，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡〔14〕。本次研究提示腦缺血再灌注可對神經(jīng)功能造成損傷，而七氟烷預(yù)處理可降低這種損傷，起到保護(hù)大鼠神經(jīng)功能的作用。TNF-α和IL-1β是常見的炎癥因子，在腦缺血再灌注損傷中起到重要作用。發(fā)生腦缺血再灌注后中性粒細(xì)胞聚集、浸潤，與血管周圍的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等多種炎性因子，發(fā)生炎癥反應(yīng)，損傷腦組織〔15〕。IL-10是天然免疫過程中的重要調(diào)節(jié)因子，可抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等多種炎性因子，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)〔16〕。在本次研究中，建立腦缺血再灌注模型后大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平增加、IL-10水平降低，而七氟烷預(yù)處理可緩解這種趨勢，降低炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果還顯示，七氟烷預(yù)處理可減少腦缺血再灌注模型大鼠的腦梗死面積，能對腦起到保護(hù)作用。七氟烷預(yù)處理能抑制血管擴(kuò)張，降低代謝程度，進(jìn)而延緩氧和葡萄糖的使用速度，減輕腦缺血引起的乳酸堆積，并且能抑制自由基合成和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕氧化性損傷〔17〕。另外，余瓊等〔18〕研究顯示，七氟烷預(yù)處理可抑制血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9上調(diào)，而上述四種指標(biāo)均含有核轉(zhuǎn)錄因子-κb 反應(yīng)元件。已有研究證明〔19〕，核轉(zhuǎn)錄因子-κb 拮抗劑可緩解腦缺血再灌注損傷。因此，可以推測，七氟烷抑制VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達(dá)也是其改善腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。

綜上所述，七氟烷預(yù)處理可有效改善缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能，并可降低血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平，減輕腦缺血再灌注后的腦梗死面積，對腦組織有一定的保護(hù)作用。

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