陳德才 王 雅 馬從乾 楊 軻 陳 輝

(南陽市中心醫(yī)院血管外科，河南 南陽 473200)

血管瘤是皮膚腫瘤中常見的良性腫瘤，在我國的發(fā)病率為5%～10%〔1〕。既往研究證明，血管內皮細胞和血管生成與血管瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系〔2〕。血管內皮細胞增殖過度和血管生長過快是血管瘤主要的生物學特征〔3〕。目前，血管瘤的分子和細胞學發(fā)病機制仍然不清楚，普遍認為由增生期、消退期、消退完成期組成，其中血管瘤細胞的增殖與凋亡對血管瘤的演進具有重要作用〔4〕。因此，血管瘤細胞的增殖、凋亡機制成為研究的熱點之一。3-磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)1對細胞的增殖、凋亡具有重要的調節(jié)作用〔5〕。因此，本實驗通過siRNA特異性抑制小鼠血管內皮細胞瘤細胞EOMA中PDK1表達，研究其表達量下降對內皮細胞增殖、凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗主要材料 小鼠血管內皮細胞瘤細胞系EOMA購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，DMEM購自美國Hyclone公司，噻唑藍(MTT)試劑盒購自美國Amresco公司，Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗體、蛋白激酶B(Akt)抗體、磷酸化(p)-Akt抗體、β肌動蛋白(actin)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling公司。

1.2細胞的培養(yǎng) EOMA細胞置于T25培養(yǎng)瓶中，加入5 ml含10% FBS、青霉素、氯霉素的新鮮DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞匯合度達到80%左右更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化細胞，每隔2～3 d按1∶3的比例進行傳代。

1.3細胞轉染 細胞轉染前24 h，將EOMA細胞接種于6孔板上，每孔2×106個細胞，放置在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞匯合度達到80%～90%時，在Lipofectamine 2000轉染試劑說明的指導下進行轉染，實驗分3組：siRNA-PDK1組中加入siRNA-PDK1、Lipofectamine 2000，siRNA-NC組中加入 siRNA-NC、 Lipofectamine 2000，對照組加入等量的培養(yǎng)基和 Lipofectamine 2000，輕輕混勻后室溫孵育15 min，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，免疫印跡試驗檢測轉染效果。

1.4MTT法檢測細胞增殖活力 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞，0.25%胰酶消化成單細胞懸液，分別接種到96孔板上，每孔1×106個細胞，每組5個復孔，37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入20 μl/孔MTT溶液，避光孵育4 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入150 μl二甲基亞砜，充分振蕩，在酶標儀490 nm波長下檢測每孔的光密度值(OD值)，計算細胞增殖活力。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數(shù)期細胞，將細胞濃度調整為1×106個/ml，分為三組分別接種在6孔板上，轉染后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞至10 ml流式離心管內，加入10 μl Annexin V-FITC，充分混勻，4℃避光反應30 min，加入10 μl PI，振動混勻，采用流式細胞儀測定各組細胞凋亡情況，重復3次。

1.6免疫印跡試驗檢測細胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表達量 棄去上清，收集細胞，加入RIPA細胞裂解液，置于冰上反應10 min，離心，收集上清，BCA法檢測蛋白濃度。加入SDS緩沖液調整蛋白濃度，100℃煮沸變性5 min，配制10%的分離膠和5%濃縮膠，取50 μg蛋白質加入上樣孔，120 V電泳至溴酚藍遷移至凝膠底部，取出凝膠，切除多余凝膠，轉移至硝酸纖維素膜上，置于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗稀釋液，4℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP標記羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，滴加化學發(fā)光試劑，用凝膠成像儀掃描，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1免疫印跡試驗檢測細胞的轉染效果 與對照組(0.852±0.063)相比，siRNA-NC組細胞中PDK1蛋白的表達量(0.838±0.539)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細胞中PDK1蛋白的表達量(0.462±0.033)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.2干擾PDK1表達對細胞增殖活性的影響 siRNA-NC組細胞增殖活性〔(99.489±0.055)%〕與對照組〔(100.232±0.054)%〕相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細胞活力〔(76.528±5.662)%〕顯著低于對照組(P<0.05)。

2.3干擾PDK1表達對細胞凋亡率的影響 與對照組〔(9.487±1.052)%〕相比，siRNA-NC組細胞凋亡率〔(10.523±1.456)%〕差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細胞凋亡率〔(27.489±5.759)%〕顯著升高(P<0.05)。

2.4干擾PDK1表達對細胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表達量的影響 與對照組相比，siRNA-NC組細胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細胞中Akt蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，p-Akt蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，酶切Caspase-3蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見圖2，表1。

圖1 轉染后細胞中PDK1蛋白表達

圖2 沉默PDK1的表達對細胞中Akt、p-Akt、 酶切Caspase-3蛋白的表達量的影響

組別Aktp-Akt酶切Caspase-3對照組0.855±0.0690.578±0.0650.445±0.068siRNA-NC組0.862±0.0730.564±0.0630.421±0.062siRNA-PDK1組0.860±0.0790.356±0.0241)0.635±0.0521)

與對照組相比：1)P<0.05

3 討 論

皮膚血管瘤是一種常見的良性腫瘤，其組織學特點為內皮細胞過度增殖〔6〕。血管瘤可產生于身體的多個部位，以皮膚和皮下組織中較常見，常采用激光、放射、激素、干擾素等多種治療方法，其中以手術治療效果較好〔7〕。但血管瘤若長在眼、耳、鼻等重要器官的特殊部位，很難以手術治療進行根除，因此較多采用非手術的方式。目前，臨床上采用的非手術方式中較多的是激素治療，長期使用的負效應較大〔8〕，所以亟需尋找一種新的非手術治療方法。PDK1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一，分子量為63 kD，含有PH結構域，與4，5-二磷酸化磷酸肌醇、3，4-二磷酸化磷酸肌醇和3，4，5-三磷酸化磷酸肌醇等磷酸肌醇類化合物有很強的分子親和力，是細胞中很多重要信號通路的關鍵因子〔9〕。研究表明PDK1在人體的多種組織中均表達，對腫瘤細胞的增殖、凋亡、上皮細胞間質轉化過程等發(fā)揮重要作用〔10〕。本實驗結果表明PDK1參與血管瘤細胞的增殖、凋亡的過程。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt參與腫瘤細胞過度增殖、血管生長、放化療的保護作用，對維持血管瘤生物學特征具有重要的調節(jié)作用〔11〕。當機體受到外界刺激，產生多種細胞因子，誘導激活PI3K磷酸化，促進第二信使3，4，5-三磷酸化磷脂酰肌醇的產生，第二信使可與具有PH結構域的蛋白如PDK1、Akt結合，從而促進Akt磷酸化，激活或抑制下游通路靶基因表達，發(fā)揮調控細胞增殖、凋亡的作用〔12，13〕。PDK1是Akt的上游基因，對PI3K/Akt信號通路及下游靶基因Caspase-3的活性均具有重要的調節(jié)作用〔14〕。PDK1可通過PI3K/Akt信號通路調節(jié)細胞一系列的生物學作用如增殖、凋亡、分化、周期等。研究〔15，16〕表明PDK1介導的PI3K/Akt信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，如乳腺癌、胰腺癌、血管瘤等，且PDK1在這些腫瘤組織中都是高表達。提示PDK1在血管瘤中可能通過影響PI3K/Akt信號通路的激活進而促使酶切Caspase-3高表達，從而調控細胞的增殖、凋亡過程。

綜上所述，沉默PDK1的表達可抑制血管瘤內皮細胞增殖，誘導其凋亡，作用機制可能與PI3K/Akt信號通路介導的下游靶基因的表達有關，為血管瘤治療方法的創(chuàng)新提供了理論基礎。

4 參考文獻

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