蘇亞楠 程 開 竇鵬揮 陳立強 王 禹

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為嚴重的記憶和認知功能減退，且伴有多種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。近年來，藥物治療主要有影響神經(jīng)遞質(zhì)的藥物，作用于β淀粉樣蛋白(Aβ)的藥物，作用于tau蛋白的藥物，神經(jīng)保護藥物等方面。目前美國FDA批準的臨床藥物有膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑〔1〕，這些藥物雖能緩解癥狀或在一定程度上改善患者的行為和認知能力，但療效有限，不能治愈或完全阻止疾病發(fā)展。因此研究開發(fā)有效預(yù)防AD疾病發(fā)生及延緩病情發(fā)展的藥物已成為當(dāng)前新藥研發(fā)的重要目標。本實驗研究山茱萸多糖對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變、糖原合成酶激酶(GSK)-3β蛋白表達的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物和分組 Wistar大鼠80只，清潔級，飼養(yǎng)室溫為20℃，自由進食飲水，自然晝夜節(jié)律光照，3月齡，體重(135.4±10.7)g。隨機分為4組：青年組、模型組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組。

1.2主要試劑 兔抗-GSK-3β(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；電化學(xué)發(fā)光底物(ECL)試劑盒、免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；Aβ1～40購自無錫亞肽生物科技有限公司；多奈哌齊購自法國PFIZER PGM公司；山茱萸多糖提取物(4∶1)購自朗林生物制品有限公司。

1.3模型制備和給藥 將白色干粉Aβ1～40溶于無菌生理鹽水中，配置成濃度為10 μg/μl Aβ1～40溶液，用前1 w放置于37℃溫箱中孵育，使其凝聚老化。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，參照文獻〔2〕配制1.25%的D-半乳糖溶液，以100 mg·kg-1·d-1的劑量進行腹腔注射，連續(xù)6 w，施行Aβ1～40海馬注射。大鼠稱重后，10%水合氯醛麻醉，380 mg/kg腹腔注射；麻醉后將模型組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組大鼠固定于腦立體定位儀上，于頭頂局部備皮、消毒，正中矢狀線切開約1.5 cm，清晰暴露前囟。參照文獻〔3〕，前后囟確定在同一水平線上，于前囟后3.72 mm、中線旁開2.0 mm處鉆一直徑約0.6 mm的孔。用微量注射器取Aβ1～402 μl，進針至硬腦膜下約3 mm，以1 μl/min的速度均勻注入凝聚態(tài) Aβ1～40溶液2 μl，2 min注射畢后，留針10 min后緩慢退出。用酒精消毒并縫合皮膚，將大鼠置于空籠內(nèi)待其蘇醒。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素10萬U預(yù)防感染。術(shù)后7 d，模型組、青年組以等量生理鹽水灌胃，多奈哌齊組以0.5 mg·kg-1·d-1灌胃，山茱萸多糖組以0.175 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)30 d，1次/d。

1.4Morris水迷宮檢測 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w、造模8 d、藥物灌胃30 d各組大鼠進行實驗。主要測試大鼠被動空間學(xué)習(xí)及記憶能力，包括定位航行試驗及空間探索試驗，測試時間是6 d。①定位航行試驗：測試時間是5 d。實驗前將大鼠頭頸部涂成黃色，有利于圖像的跟蹤采集；可視平臺放置于某一象限的中心及備好實驗用水，水溫(25±1)℃等。實驗分成上下午兩階段，每階段訓(xùn)練4次，依次以水池的4個象限為大鼠入水點讓大鼠面向池壁。大鼠游泳至找到水下的平臺為止，如果大鼠在2 min之內(nèi)找到平臺，讓其在平臺停留0.5 min；如果大鼠在水池內(nèi)游泳至2 min后未找到平臺，將大鼠引致平臺，讓其在平臺上停留0.5 min，達到加強記憶的作用。在大鼠每次訓(xùn)練后注意保溫，休息1 min進行下面的訓(xùn)練。記錄每次大鼠訓(xùn)練尋找平臺的軌跡圖，4個不同象限的平均值是該次逃避潛伏期。②空間探索試驗：用于檢測大鼠的空間記憶能力。實驗第6天撤除平臺，將大鼠隨機任選一個入水點放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)在原平臺所在象限的停留時間及穿越原平臺位置的次數(shù)。

1.5取材和檢測 大鼠藥物干預(yù)30 d后，將實驗大鼠用乙醚(1～2滴/鼠，5 min左右)深麻醉后固定于木板上，快速剪開胸骨，將灌注針沿左心室插入主動脈，固定針頭，剪開右心耳放血，用溫0.9%生理鹽水沖洗殘余血液，至四肢蒼白為止；換上4%多聚甲醛溶液進行心臟灌注固定腦組織，先快后慢，直到大鼠全身僵硬。斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，4℃冰箱保存。于大鼠腦組織海馬處取材，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片，片厚5 μm，40℃水浴中展片，用經(jīng)多聚賴氨酸0.1 mg/ml防脫片處理過的載玻片撈片，置于60℃烤箱烘烤1 h后進行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)法，檢測海馬GSK-3β蛋白的表達。圖像采集用Image-Pro Plus6.0分析軟件計算陽性染色的平均光密度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD(L)和S-N-K(S)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組定位航行試驗結(jié)果比較 干預(yù)前與青年組比較，模型組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組大鼠逃避潛伏時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后青年組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組與模型組比較明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。多奈哌齊組、山茱萸多糖組大鼠逃避潛伏時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組干預(yù)前、后平均逃避潛伏期

與青年組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.2各組空間探索能力比較 造模后，模型組、多奈哌齊組及山茱萸多糖組穿越原平臺次數(shù)明顯少于青年組(P<0.05)；藥物干預(yù)后與模型組比較，多奈哌齊組、山茱萸多糖組穿越原平臺次數(shù)均明顯增加(P<0.05)；多奈哌齊組、山茱萸多糖組大鼠穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3組織病理學(xué)觀察 在海馬CA2區(qū)，與青年組比較，模型組CA2區(qū)神經(jīng)元顯著丟失，錐形細胞呈松散排列，山茱萸多糖組、多奈哌齊組與模型組比較海馬組

織病理學(xué)顯著改善，見圖1。

表2 各組干預(yù)前、后2 min內(nèi)穿越原平臺次數(shù)次，n=20)

圖1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)觀察(HE，×400)

2.4各組海馬GSK-3β表達 在海馬CA2區(qū)，模型組海馬GSK-3β蛋白表達(0.506±0.064)明顯高于青年組(0.235±0.028，P<0.05)；與模型組比較，山茱萸多糖組(0.405±0.058)，多奈哌齊組(0.418±0.041)GSK-3β蛋白表達明顯減弱(P<0.05)。而山茱萸多糖組與多奈哌齊組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 大鼠海馬CA2區(qū)GSK-3β蛋白表達(DAB，×400)

3 討 論

AD早期特征性病理損害兩大主要特征是神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)〔4〕和細胞外Aβ聚集導(dǎo)致老年斑(SP)形成〔5，6〕。雙股螺旋纖維(PHF)是NFTs的主要成分，導(dǎo)致這兩種病理改變的最重要原因是tau蛋白的過度磷酸化。tau蛋白是神經(jīng)細胞中含量最高的微管相關(guān)蛋白，對促進微管的形成和維持微管穩(wěn)定性有著非常重要的作用。tau蛋白被過度磷酸化，即喪失了促進微管組裝的生物學(xué)活性，也具有神經(jīng)毒性〔7〕。有實驗表明〔8〕，AD患者的臨床癡呆程度僅與NFTs的數(shù)量密切相關(guān)。AD中tau蛋白的異常過度磷酸化被認為是AD致病的關(guān)鍵因素。tau蛋白過度磷酸化主要受到蛋白激酶活性與磷酸酯酶活性的調(diào)控，對tau蛋白磷酸化起主要調(diào)節(jié)作用的是GSK-3β〔9〕。AD患者腦中，在有纏結(jié)的神經(jīng)元中可以檢測到大量活性形式的GSK-3β的聚集，提示GSK-3β可能與過度磷酸化的tau蛋白直接相關(guān)，而抑制GSK-3β活性水平可顯著改善多種因素誘導(dǎo)的tau過度磷酸化及動物認知障礙〔10〕。GSK-3β可使tau多個AD相關(guān)位點發(fā)生過度磷酸化，同時GSK-3β還能增加Aβ的神經(jīng)毒性，進一步增加神經(jīng)纖維纏結(jié)〔10〕。所以調(diào)節(jié)GSK-3β和磷酸化GSK-3β的活性是減輕AD早期病理改變的重要手段之一。研究也證實〔11〕，體內(nèi)GSK-3β含量變化與AD病理進展程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果說明山茱萸多糖對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力起到良好改善作用，間接證明對海馬區(qū)的功能有保護和修復(fù)作用。

山茱萸是中醫(yī)名貴藥材之一，是山茱萸的干燥果肉，又名山萸肉、肉棗等，其味酸、澀、微溫，是我國的傳統(tǒng)中藥材。《本草綱目》載：山茱萸，主治心下邪氣寒熱，溫中，逐寒溫痹，去三蟲，久服輕身；有強陰益精、安五臟、通九竅、止小便淋瀝之功；久服明目、強力長年〔12〕?，F(xiàn)代化學(xué)分析方法證實山茱萸的化學(xué)成分包括山茱萸甙、環(huán)烯醚萜苷、五環(huán)三萜酸、酒石酸、鞣質(zhì)、多糖類、蘋果酸和多種維生素等〔13〕?，F(xiàn)已明確山茱萸多糖主要成分是PFCC、PFCAⅢ、SZYP-2、Co-4等〔14〕，是山茱萸的生物學(xué)活性物質(zhì)重要成分，有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強免疫功能、抗衰老、降低血糖血脂保護心腦血管系統(tǒng)等重要的藥理作用。

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