徐麗華，李軍星，蘇 菲，田瑞雨，王 賽，袁秀芳(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)最早于1987年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后在短短幾年內(nèi)迅速遍及全球各個(gè)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)[1-2]。1996年，我國(guó)首次在北京分離到PRRSV，隨后在我國(guó)豬群中感染率逐年上升，某些地區(qū)豬群血清陽性率已達(dá)50%～80%。PRRSV主要引起母豬的繁殖障礙與新生仔豬的呼吸道疾病，以及免疫抑制和持續(xù)性感染，造成仔豬的高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]，豬繁殖與呼吸綜合征是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的最主要傳染病之一。

豬場(chǎng)中豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的診斷檢測(cè)，一般根據(jù)其流行病學(xué)、臨床癥狀以及剖檢情況進(jìn)行初步診斷，再應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行確診。目前PRRSV的檢測(cè)方法主要有反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和電鏡觀察等[6]。這些檢測(cè)方法都存在檢測(cè)成本高、需要一定的儀器設(shè)備、需要具備相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能的技術(shù)員進(jìn)行操作等缺點(diǎn)，不適于基層臨床使用[6]。

膠體金免疫技術(shù)是80年代繼熒光素、放射性同位素和酶3大標(biāo)記技術(shù)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)[7]。該方法最初僅用于免疫電鏡技術(shù)，現(xiàn)在已發(fā)展到免疫印跡、免疫斑點(diǎn)滲濾法及免疫層析法等方法，并廣泛應(yīng)用于臨床診斷中。膠體金免疫技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速、單份測(cè)定、特異敏感，且不需要任何儀器設(shè)備，在幾分鐘內(nèi)就可觀察到顏色對(duì)比鮮明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等特點(diǎn)，具有很大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)綜合應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，探索建立斑點(diǎn)膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)，試圖為臨床提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異的檢測(cè)PRRSV手段。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清采自臨床健康斷奶仔豬，經(jīng)美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)試劑盒鑒定；凍干酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白購(gòu)自上?？菩郎锟萍佳芯克慌Ｑ灏椎鞍踪?gòu)自上海華美生物工程公司；弗氏佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；氯化金、檸檬酸三鈉、碳酸鉀、辛酸、硫酸銨等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；0.45 μm硝酸纖維素薄膜為浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠出品。

1.2 工具酶和菌種

限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶購(gòu)自上海生工生物工程公司；100 bp DNA Marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker、凝膠回收試劑盒(Lot0307)購(gòu)于上海申能博彩生物科技有限公司。原核表達(dá)載體pET-28 a(+)由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院余旭平副教授惠贈(zèng)。受體菌E.coliDH5α和E.coliBL21-plysS由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 兔抗豬IgG多克隆抗體的制備及純化

采集臨床健康豬血清，辛酸-硫酸銨法提取豬IgG[10-11]，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)豬IgG的純度，Lowry法測(cè)定蛋白濃度。與弗氏完全佐劑或不完全佐劑等量混合制成乳液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

從浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所種兔場(chǎng)選取1.5～2 kg體重的新西蘭兔2只，首次用含弗氏完全佐劑的豬IgG乳液進(jìn)行足墊免疫，每只兔注射0.4 mL。隔14 d后，用含弗氏不完全佐劑的豬IgG乳液進(jìn)行第2次免疫；14 d后進(jìn)行第3次免疫；再隔10 d，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行耳靜脈采血。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)，達(dá)到預(yù)期效價(jià)后，進(jìn)行心臟采血，分離血清，再應(yīng)用辛酸-硫酸銨法初步純化兔抗豬IgG，測(cè)定多抗的蛋白濃度。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

采集臨床疑似PRRS的組織病料，提取病毒基因組RNA，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出特異性條帶，經(jīng)測(cè)序分析后確定為PRRSV核衣殼蛋白的全基因序列，命名為PRRSV/N。將PRRSV/N片段和原核表達(dá)載體pET-28 a(+)進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)入受體菌E.coliBL21-pLysS中，取得單菌落，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切鑒定后，將陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基(含50 U·mL-1卡那霉素)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收集菌體，經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)蛋白。Western blot驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性。

1.5 表達(dá)蛋白的純化

表達(dá)蛋白的純化按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)操作[12]。純化蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE電泳后，將凝膠用3 mol·L-1KCl溶液顯色，切下目的條帶，重蒸水沖洗，放入電濃縮裝置中進(jìn)行電濃縮4～5 h。吸取濃縮液裝入透析袋中，用0.02 mol·L-1Tris-HCl，0.9% NaCl溶液透析過夜，即得純化蛋白。

1.6 膠體金的制備及標(biāo)記

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[13-14]。先取100 mL雙蒸水，加入1%氯金酸水溶液1 mL制成終濃度為0.1%溶液，用恒溫磁力攪拌器加熱攪拌，沸騰后立即加入2 mL新鮮配制的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱并劇烈攪拌，等溶液顏色穩(wěn)定為酒紅色，停止加熱攪拌，用雙蒸水補(bǔ)足到原體積，冷卻至室溫。用0.2 mol·L-1K2CO3調(diào)至pH值8.2，在磁力攪拌下加入0.8 mg提純的兔抗豬IgG多克隆抗體，攪拌15 min后加入BSA至終濃度為0.5 g·L-1，繼續(xù)攪拌10 min后取出。混合物先在4 ℃，4 000 r·min-1，離心10 min；取上清再用高速冷凍離心機(jī)，13 000 r·min-1，4 ℃離心30 min；棄上清，沉淀用0.02 mol·L-1Tris-HCl(pH值7.4)、0.2% BSA溶液洗滌1次，按原始體積的1/10將沉淀重懸于膠體金保存液(0.02 mol·L-1Tris-HCl，0.5% BSA)，4 ℃保存?zhèn)溆?。制備的膠體金委托浙江大學(xué)科學(xué)樓電鏡室作電鏡檢查。

1.7 斑點(diǎn)膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的建立

剪取大小為0.5 cm×0.5 cm、孔徑為0.45 μm的硝酸纖維素薄膜(NCM膜)，直接點(diǎn)樣加上PRRSV/N純化蛋白，室溫干燥后，用1%脫脂奶粉封閉30 min，0.01 mol·L-1PBS(pH值7.2)洗滌3次，將NCM膜粘于0.5 cm×5 cm的塑料棒上成檢測(cè)試劑條。用PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清，1∶50稀釋后與NCM膜作用30 min，0.01 mol·L-1PBS(pH值 7.2)洗滌3次，直接加入已標(biāo)記好的膠體金懸液中，室溫5 min，肉眼觀察結(jié)果。同時(shí)進(jìn)行Dot-ELISA法檢測(cè)，驗(yàn)證結(jié)果的正確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔抗豬IgG多克隆抗體的制備

實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)豬IgG三次免疫后，耳靜脈采血，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定，抗體效價(jià)已達(dá)1∶16(圖1)。所有免疫兔心臟采血，分離血清，辛酸-硫酸銨法純化兔抗豬IgG，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，主要呈現(xiàn)IgG分子的2個(gè)條帶(圖2)。Lowry法測(cè)定兔抗豬IgG蛋白濃度為14.6 mg·mL-1。

圖1 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定兔抗豬IgG抗體效價(jià)

M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1為兔抗豬血清；2為兔抗豬IgG抗體圖2 SDS-PAGE電泳檢測(cè)兔抗豬IgG抗體

2.2 PRRSV/N基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

RT-PCR技術(shù)，從臨床組織病料中擴(kuò)增出PRRSV的核衣殼蛋白全基因序列，電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(圖3)。

M為100 bp DNA Ladder plus；1為PRRRSV A/N基因圖3 PRRSV/N基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將擴(kuò)增的PRRSV/N片段和原核表達(dá)載體pET-28a(+)連接并轉(zhuǎn)入BL21感受菌后，獲得單菌落，經(jīng)雙酶切鑒定后(圖4)，測(cè)序驗(yàn)證克隆正確。

M為pUC19 DNA/Mspl(Hpa11)+Lambda DNA/Hind111 Marker；1為PRRSV A/N雙酶切結(jié)果圖4 PRRSV/N雙酶切產(chǎn)物

2.3 融合蛋白的表達(dá)及免疫印跡檢測(cè)

正確克隆的轉(zhuǎn)化子用IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)15% SDS-PAGE電泳和染色分析發(fā)現(xiàn)，重組PRRSV/N蛋白獲得了高效表達(dá)，目標(biāo)蛋白的分子量約為17 ku(圖5)，與預(yù)期相符。

1為pET-PRRSV/N誘導(dǎo)前菌體蛋白；2為pET-PRRSV/N誘導(dǎo)后菌體蛋白；M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker圖5 SDS-PAGE檢測(cè)

表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜后，分別以PRRSV陰性和陽性血清進(jìn)行Western blot分析。顯色結(jié)果表明，表達(dá)蛋白可被PRRSV陽性血清所識(shí)別，馬上出現(xiàn)清晰的條帶；而與陰性血清作用，呈陰性反應(yīng)(圖6)。

1為陽性血清檢測(cè)重組蛋白；2為陰性血清對(duì)照；M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker圖6 重組蛋白的Western-Blot檢測(cè)

2.4 融合蛋白的純化

pET在大腸桿菌中表達(dá)出PRRSV/N后，表達(dá)蛋白以包涵體形式存在。將細(xì)菌裂解后收集包涵體，用8 mol·L-1尿素裂解，再經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，表達(dá)蛋白純度在90%以上，蛋白濃度為20.6 mg·mL-1(圖7)。將PRRSV/N初步純化的蛋白再經(jīng)過SDS-PAGE電泳，割取凝膠進(jìn)行電濃縮，透析取得純化蛋白。

1為PRRSV/N融合蛋白；2、3、4分別為PRRSV/N純化蛋白倍比稀釋；M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker圖7 為PRRSV/N純化蛋白倍比稀釋SDS-PAGE檢測(cè)

2.5 斑點(diǎn)膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)的建立

在100 mL氯金酸溶液中加入2 mL 1%檸檬酸三鈉水溶液，燒制出的膠體金經(jīng)電鏡觀察，直徑在18～20 nm，跟文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相符合(圖8)。

圖8 電鏡觀察膠體金顆粒(10萬倍)

選取PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清，用標(biāo)記好的膠體金作用，在5～10 min內(nèi)就可以看到清晰的顯色，且陰陽性對(duì)比明顯(圖9)。

圖9 斑點(diǎn)膠體金檢測(cè)PRRSV陰陽性血清結(jié)果

3 討論

近年來，PRRSV在我國(guó)的不同省、市、自治區(qū)都存在不同程度的流行，其感染率高，造成的損失很大，給養(yǎng)豬戶帶來了極大的困擾。目前檢測(cè)PRRSV主要應(yīng)用美國(guó)IDEXX生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)試劑盒，但該方法檢測(cè)不但價(jià)格較高(每頭檢測(cè)成本高達(dá)30～50元)，而且需要一定的設(shè)備和實(shí)驗(yàn)操作要求，另外整個(gè)檢測(cè)過程需要2～3 h，臨床上難以推廣應(yīng)用。因此，建立一種方便、快捷且準(zhǔn)確的診斷方法，對(duì)及時(shí)預(yù)防該病具有重要意義。

膠體金免疫技術(shù)是以膠體金作為顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和不需要任何實(shí)驗(yàn)儀器等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，而在動(dòng)物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用還不多，具有很大的開發(fā)前景。

制備膠體金的方法很多，主要有檸檬酸三鈉還原法、檸檬酸三鈉-鞣酸還原法、白磷還原法等，其中檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金顆粒比較均勻一致。本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸三鈉還原法，通過對(duì)不同用量的檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)，以及制備膠體金顆粒的最佳反應(yīng)時(shí)間等的摸索，最后證明100 mL氯金酸溶液，用2 mL檸檬酸三鈉還原最好，制備出的膠體金顆粒大小較均勻，直徑在18～20 nm。另外，pH值對(duì)膠體金標(biāo)記的影響也很大，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們將二抗標(biāo)記時(shí)pH值調(diào)至8.2，實(shí)驗(yàn)證明，最后反應(yīng)效果較好。

斑點(diǎn)膠體金法檢測(cè)抗原或抗體出現(xiàn)特異性反應(yīng)，最重要是需要高純度的純化抗原。在PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白中，核衣殼蛋白(N蛋白)是保守性蛋白，其免疫原性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)選取了N蛋白為研究對(duì)象，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)以融合蛋白的形式高效表達(dá)了該蛋白，并以包涵體的形式存在。用細(xì)菌裂解液裂解菌體，所得包涵體再用8 mol·L-1尿素裂解，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)得到初步純化的蛋白濃度比較高，再經(jīng)過電濃縮，蛋白復(fù)性液透析后得到高濃度的純化蛋白。經(jīng)過Western blot分析，表明該蛋白能與PRRSV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，非特異性背景很低；而和PRRSV陰性血清作用后則無反應(yīng)，說明純化蛋白具有很高的反應(yīng)特異性。另外，PRRSV/N蛋白的等電點(diǎn)為10.7，其中有1個(gè)二硫鍵，因此選用pH值為11的蛋白復(fù)性液進(jìn)行透析，效果較好。將純化蛋白點(diǎn)在NCM膜上，經(jīng)PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清作用后，直接浸于標(biāo)記好的膠體金中，5～10 min就可以用肉眼直接觀察結(jié)果，其中陽性血清作用后，NCM膜上出現(xiàn)清晰的鮮紅色斑點(diǎn)，而陰性血清作用的NCM膜上無斑點(diǎn)出現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)采用斑點(diǎn)膠體金法，除了用膠體金標(biāo)記代替酶標(biāo)記和酶底物外，其原理及操作與Dot-ELISA法基本相同，檢測(cè)的靈敏度和特異性也相仿。因前者比后者減少底物顯色步驟，同時(shí)色彩鮮明反差強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間更短，30～40 min即可檢測(cè)結(jié)果。此外，具有可肉眼直接觀察結(jié)果、單份測(cè)定、操作簡(jiǎn)便、能在基層使用等優(yōu)點(diǎn)。目前我們正進(jìn)一步提高膠體金檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性，同時(shí)進(jìn)行臨床檢測(cè)試驗(yàn)。

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