彭 蕊 王雅茹 王 媛

（1衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北 衡水 053000；2哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院 河北 衡水 053000；3衡水志豪畜牧科技股份有限公司 河北 衡水 053000）

紫花苜蓿是一種重要的飼草，分布廣泛，品質(zhì)優(yōu)良，適口性好，所以有“牧草之王”的美稱，但粗纖維含量高、蛋白質(zhì)消化率低限制了其利用程度。對苜蓿濃縮蛋白的提取的研究雖然較為成熟，但更深層次的研究較少，整體利用率低。發(fā)酵可以一定程度上改善飼料的營養(yǎng)成分，提高牲畜利用率，同時(shí)由于益生菌及酶活性增加，其免疫性能也得到提高[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。酵母菌(yeast)、米曲霉(Asp.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)均由衡水學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 原料。紫花苜蓿，由衡水志豪畜牧科技有限公司提供。

1.1.3 儀器。凱氏定氮儀(ATN-300型)，石墨消解儀(DS-360)，鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9075A)，超凈工作臺(tái)(JB-CJ-1500FX)，恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9160(A))。

1.2 方法

1.2.1 制備發(fā)酵原料。苜蓿洗凈，烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。制備干發(fā)酵料(苜?！糜驮?17∶3)，分裝于36個(gè)組培瓶中。18瓶121℃滅菌30 min，冷卻，烘干。制備發(fā)酵原料(發(fā)酵料∶自來水=1∶2)。

1.2.2 菌種活化及培養(yǎng)。40℃葡萄糖水中活化菌種，接入PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑選生長良好的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)(枯草芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng))。

1.2.3 制備菌懸液。無菌水制菌懸液，經(jīng)測定，酵母菌、枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別為5.1×109個(gè)/ml、1.25×109個(gè)/ml，米曲霉、黑曲霉孢子數(shù)為分別1.22×109CFU/ml、1.31 ×109CFU/ml。

1.2.4 接種與發(fā)酵。經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵原料按不接菌、接單菌(酵母菌、黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌)、接4種混合菌(各1.25 ml)進(jìn)行處理，各3個(gè)重復(fù)。未滅菌原料相同。將接種好的組培瓶放35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.5 測定。在第0 d、5 d、10 d、15 d取產(chǎn)物，凱氏定氮法測定粗蛋白含量，酸性洗滌劑法測粗纖維含量，用DNS法測還原糖含量，計(jì)算纖維素酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗蛋白含量。經(jīng)測定得知發(fā)酵前粗蛋白含量為14.6%。由表1～3可知，自然發(fā)酵下粗蛋白增率低于滅菌發(fā)酵。單就各菌種而言，黑曲霉最佳，而混菌發(fā)酵又優(yōu)于單菌發(fā)酵。綜合分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵5 d、10 d、15 d中蛋白含量呈遞增趨勢。

表1 發(fā)酵5 d粗蛋白含量 (單位：%)

表2 發(fā)酵10 d粗蛋白含量 (單位：%)

表3 發(fā)酵15 d粗蛋白含量 (單位：%)

2.2 粗纖維含量。經(jīng)測定得知發(fā)酵前粗纖維含量為38%。由表4～6可知，自然發(fā)酵下粗纖維減少程度高于滅菌條件。單菌中黑曲霉最佳，而混菌發(fā)酵又優(yōu)于單菌發(fā)酵。5 d、10 d、15 d中粗纖維減少程度逐漸增強(qiáng)。

表4 發(fā)酵5 d粗纖維含量 (單位：%)

表5 發(fā)酵10 d粗纖維含量 (單位：%)

表6 發(fā)酵15 d粗纖維含量 (單位：%)

2.3 纖維素酶活性。經(jīng)測定得知發(fā)酵前纖維素酶活力為15 U/g。由表7～9可知，自然發(fā)酵下纖維素酶活性增率低于滅菌條件。單菌中黑曲霉最佳，混菌發(fā)酵優(yōu)于單菌發(fā)酵。5 d、10 d、15 d中酶活性呈遞增趨勢。

表7 發(fā)酵5 d纖維素酶活力

表8 發(fā)酵10 d纖維素酶活力

表9 發(fā)酵15 d纖維素酶活力

3 討論

混菌發(fā)酵充分利用各菌優(yōu)勢，不同菌種可以互補(bǔ)不足。酵母菌可生產(chǎn)單胞蛋白，菌體蛋白飼喂試驗(yàn)效果明顯[2]。由于酵母菌不能利用多糖為碳源，所以在只接酵母菌的發(fā)酵原料中粗蛋白含量增長較慢。試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)物中粗纖維含量下降，這是由于各微生物酶系的相互作用導(dǎo)致的。如黑曲菌與米曲霉發(fā)酵過程中可產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶等十幾種酶類，這些酶水解活性好，可促進(jìn)飼料中纖維素等成分降解，提高飼料利用率[3]。隨時(shí)間延長，微生物不斷繁殖產(chǎn)生菌體蛋白、消耗粗纖維等，使苜蓿飼料的營養(yǎng)成分及酶活性發(fā)生變化。對苜蓿飼料的長時(shí)間發(fā)酵及利用有待進(jìn)一步研究以指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

[1]皮祖坤.生物蛋白飼料研究 [J].中國飼料，2004(9)： 38～40.

[2]鄭奮新.菌體蛋白生物飼料在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究 [J].福建畜牧獸醫(yī)，2003，25(Z1)：17～18.

[3]李明，雙寶，李海濤，等.枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)，2009，40(9)：111～114.