吳元圣，李 雄，楊永平 ，楊永紅

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲(chóng)害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650201；3 中國(guó)科學(xué)院 昆明植物研究所西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù), 昆明 650201)

植物必需礦質(zhì)元素(如Mg、Fe、Na、Cu、Zn等)在植物中起著廣泛的作用，適量的礦質(zhì)元素對(duì)維持植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用，若植物的生長(zhǎng)過(guò)程中缺少某種必需元素，則植物會(huì)發(fā)生相應(yīng)的生理生化變化而影響其生長(zhǎng)發(fā)育[1-3]。但是這些元素(特別是微量元素)過(guò)量的積累也會(huì)對(duì)植物造成毒害[4]。此外，由于Cd、Pb和Hg等植物非必需金屬元素和某些必需礦質(zhì)元素有類似的化學(xué)性質(zhì)，同樣會(huì)被植物吸收，從而對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[5]。近年來(lái)隨著重金屬污染事件的頻繁發(fā)生，重金屬污染的防治工作越來(lái)越受到重視。重金屬污染土壤的修復(fù)是指利用物理、化學(xué)、生物或組合的方法來(lái)固定、富集或去除重金屬使其濃度降低至無(wú)害水平[6]。物理化學(xué)方法通?？梢詭?lái)快速的效果，但大部分成本高且會(huì)產(chǎn)生二次污染[7]，因此難以廣泛應(yīng)用。生物修復(fù)指通過(guò)生物體的代謝活動(dòng)降低土壤中的重金屬濃度，主要通過(guò)微生物修復(fù)和植物修復(fù)來(lái)進(jìn)行[8]。微生物修復(fù)具有成本低、環(huán)保效益和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9]。但是微生物修復(fù)本身也存在問(wèn)題，例如微生物生長(zhǎng)的環(huán)境和收集細(xì)菌等問(wèn)題[10]。因此，植物修復(fù)技術(shù)已成為近年來(lái)的主要選擇[11-12]。植物修復(fù)是利用植物對(duì)重金屬的吸附或吸收來(lái)降低土壤重金屬的生物有效性[13]。植物修復(fù)效率很大程度上依賴于植物對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，因此研究植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的分子機(jī)制，挖掘其中的關(guān)鍵基因具有重要意義。已有研究表明，一些金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子，這些金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括P型ATP酶、陽(yáng)離子擴(kuò)散促進(jìn)蛋白(CDF)家族和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[14]。

重金屬ATP酶(HMA)是P型ATP酶的亞家族之一，能夠利用ATP水解釋放的能量轉(zhuǎn)運(yùn)多種重金屬穿越細(xì)胞膜[14]，是超富集植物依賴的一類重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[15]。在擬南芥和水稻中分別鑒定出了8個(gè)和9個(gè)HMA蛋白，分別命名為AtHMA1～AtHMA8和OsHMA1～OsHMA9，根據(jù)主要轉(zhuǎn)運(yùn)底物和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可以分為2個(gè)亞類：Zn/Cd/Co/Pb亞類(包括AtHMA1～AtHMA4和OsHMA1～OsHMA3)和Cu/Ag亞類(包括AtHMA5～AtHMA8和OsHMA4～OsHMA9)[16]。研究表明，HMA家族在維持植物正常條件下微量金屬元素的平衡和提高重金屬耐受性方面發(fā)揮重要的作用[17]。例如：水稻OsHMA2基因突變體對(duì)Zn2+和Cd2+的轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯降低[18]。擬南芥和水稻中AtHMA3和OsHMA3基因都能夠向根液泡中轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+，從而減少Cd2+向地上組織的轉(zhuǎn)移[19-21]。AtHMA4基因在調(diào)節(jié)擬南芥中Cd2+和Zn2+的含量具有重要作用，能夠介導(dǎo)Cd2+和Zn2+通過(guò)木質(zhì)部向莖尖的轉(zhuǎn)運(yùn)[22-23]。與大多數(shù)HMA成員功能不同的是，水稻中OsHMA9基因能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的Cd、Zn、Pb等重金屬排至胞外[23]。盡管對(duì)于模式植物擬南芥和水稻中HMA基因的功能研究開(kāi)展較早，研究也較為深入，但關(guān)于其他植物特別是重金屬超富集植物中HMA基因的功能研究還相對(duì)較少。

十字花科物種在探索金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能方面顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。其原因在于(1)該類植物包括模式植物(擬南芥)；(2)許多重要的蔬菜和油料作物基因組數(shù)量不斷增加；(3)十字花科植物對(duì)2種重要的非生物脅迫(鹽脅迫和重金屬積累)的耐受性差別很大[24-26]。其中，蕪菁(Brassicarapavar.rapa)是十字花科蕓薹屬能形成肉質(zhì)根的2年生草本植物，在歐洲、亞洲和美洲均有栽培[27]。蕪菁和其他十字花科蔬菜作物一樣，是土壤中重金屬遷移到動(dòng)物和人體的重要媒介，在重金屬和植物的相互作用研究中具有重要角色。前期研究發(fā)現(xiàn)蕪菁屬于Cd2+高積累型植物[28]，但關(guān)于蕪菁對(duì)重金屬的耐受或轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制的研究還很少。本研究從蕪菁中克隆得到HMA家族的1對(duì)同源基因BrrHMA2.1和BrrHMA2.2，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析，為進(jìn)一步研究HMA家族基因在蕪菁吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為來(lái)自四川省鄉(xiāng)城縣當(dāng)年采集的成熟蕪菁種子。將種子播種在盛有混合營(yíng)養(yǎng)土的塑料花盆里，每盆播種約3～4粒，共40盆；然后在23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)36 h，待種子萌發(fā)后，移入溫室(晝夜溫度20/25 ℃；晝夜時(shí)間: 8 h/16 h；相對(duì)濕度75%～80%)培養(yǎng)5～6周后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1RNA提取和cDNA合成選取生長(zhǎng)良好的蕪菁幼苗，剪取其幼嫩葉片，采用總RNA提取試劑盒(Eastep Super，上海)從蕪菁樣品中提取總RNA，取RNA樣品3 μg，反轉(zhuǎn)錄(Promega，上海)合成cDNA第1條鏈。

1.2.2BrrHMAs基因克隆根據(jù)蕪菁轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)的CDS序列，設(shè)計(jì)克隆引物BrrHMA2.1-F(5′-ATGGCGACCAAGAACGAGAA-3′)和BrrHMA2.1-R(5′-ACAGTCACCACCATGAGTGA-3′)，BrrHMA2.2-F(5′-ATGGCGTCCAAGAACGA-TAA-3′)和BrrHMA2.2-R(5′-ATGATCACCACCATGCATGA-3′)，以cDNA第1條鏈為模板進(jìn)行BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物利用DNA凝膠回收試劑盒(TransGen Biotech，北京)進(jìn)行純化回收。將純化產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并測(cè)序。

1.2.3BrrHMAs基因的序列分析利用Swiss Institute of Bioinformatics 網(wǎng)站的ExPASy翻譯工具(http://au.expasy.org/tools/dna.html)將全長(zhǎng)cDNA序列翻譯成蛋白序列；利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Nucleotide Blast進(jìn)行序列比對(duì)分析；用ProtParam工具(http://expasy.org/tools/)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量大小、氨基酸組成、等電點(diǎn)及疏水性。用GeneDoc軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，InterPro網(wǎng)站預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域。用MEGA6軟件選擇鄰接法(neighbor～joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.4表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位以測(cè)序正確的BrrHMA2.1/pMD18-T和BrrHMA2.2/pMD18-T重組質(zhì)粒為模板，用引物BrrHMA2.1-F-101(5′-GACCCCGGGGGTACCGGATCCATGGCGA-CCAAGAAC GAGAA-3′)和BrrHMA2.1-R-101(5′-TCAGAATTCGGATCCTCACTCATGGTGGTGACT-GT-3′)，BrrHMA2.2-F-101(5′-GACCCCGGGGGTACCGGATCCATGGCGTCCAAGAACGATAA-3′)和BrrHMA2.2-R-101(5′-TCAGAATTCGGATCCTCATGCATGGTGGTG-ATCAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物使用DNA凝膠回收試劑盒純化。將PCR純化產(chǎn)物以及空的101GFP載體用BamH I內(nèi)切酶單酶切，并用連接酶(ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，南京)連接30 min，構(gòu)建GFP- BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中并測(cè)序確認(rèn)。構(gòu)建好的質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株感受態(tài)細(xì)胞中。將含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105通過(guò)注射液(含1/2MS、50%蔗糖、0.3% Silwet、乙酰丁香酮，pH 5.7)注射到本氏煙草(NicotianabenthamianaL.)葉片中，正常生長(zhǎng)3 d后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察葉片下表皮的綠色熒光蛋白(GFP)熒光。

1.2.5BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在蕪菁不同生長(zhǎng)時(shí)期及重金屬脅迫處理下的表達(dá)分析利用Step one plusTm熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。選取生長(zhǎng)18、36、42和50 d的蕪菁幼苗和用不同金屬脅迫處理(10 mg·L-1MgCl2·6H2O、 2 mg·L-1ZnSO4·7H2O、5 mg·L-1CuSO4·5H2O、2.5 mg·L-1FeCl2·4H2O、2 mg·L-1CoCl2·6H2O、2.5 mg·L-1NaCl、2 mg·L-1CdCl2·2.5H2O)的蕪菁幼苗，分別提取葉片和根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)2個(gè)基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為20 μL，主要包括：EvaGreen 2X qPCR Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)ree-H2O 6.8 μL。PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃ 預(yù)變性30 s，94 ℃ 變性5 s，59 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。以蕪菁Tubulin基因作為內(nèi)參，qPCR反應(yīng)所用引物為qBrrTUB2-F(5′-AGGCGTGTGAGTGAGCAG-TT-3′)和qBrrTUB2-R(5′-CATCTCGTCCATTCCTTC-ACCTGT-3′)；qBrrHMA2.1-F(5′-AAGAACCGTCATCGTCGTCC-3′)和qBrrHMA2.1-R(5′-GAGAAGTACGCCGGAAACCA-3′)；qBrrHMA2.2-F(5′-GTTTCCGGCGTACTTCTCCT-3′)和qBrrHMA2.2-R(5′-GTGACGATGAACTCGCCTCT-3′)。

1.2.6數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量；利用SPSS 18軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用單因素ANOVA檢驗(yàn)；利用SigmaPlot 10.0軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BrrHMAs基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以蕪菁cDNA為模板，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后送樣品測(cè)序，得到BrrHMA2.1和BrrHMA2.2完整的cDNA序列。

Marker. DL5000

BrrHMA2.1基因的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框?yàn)? 619 bp(圖1)，編碼872個(gè)氨基酸，將其命名為BrrHMA2.1，序列提交到GenBank，登錄號(hào)為MG_283237。將該蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白和白菜(Brassicarapavar.pekinensis)HMA2(登錄號(hào)為XM_009129842)具有99%的相似性。BrrHMA2.2基因的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框?yàn)? 724 bp(圖1)，編碼907個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為MG_283238，該蛋白和白菜HMA2-like(登錄號(hào)為XM_009139642)具有99%的相似性。

ProtParam工具預(yù)測(cè)BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白的分子量分別為94.19和97.45 kD，理論等電點(diǎn)分別為6.69和7.64。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有1個(gè)HMA保守結(jié)構(gòu)域。BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白具有6個(gè)跨膜螺旋區(qū)(圖2)。

2.2 BrrHMAs基因的進(jìn)化分析

采用MEGA6軟件的NJ法對(duì)BrrHMA2.1、BrrHMA2.2及AtHMA家族10個(gè)蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)。結(jié)果表明，BrrHMA2.1、BrrHMA2.2與AtHMA2(GenBank ANM67783.1)的分支關(guān)系較近。序列相似的基因可能具有相似的功能。

因此，BrrHMA2.1、BrrHMA2.2基因可能與AtHMA2基因功能相似。

2.3 BrrHMAs蛋白的亞細(xì)胞定位分析

為了研究BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在細(xì)胞中的作用位置， 本研究構(gòu)建GFP-BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌EHA105菌株將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到煙草葉片中。轉(zhuǎn)化3 d后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片下表皮中表達(dá)載體的表達(dá)情況(圖4)。研究表明，GFP-BrrHMA2.1和GFP-BrrHMA2.2融合蛋白在細(xì)胞膜上特異表達(dá)。

2.4 BrrHMAs基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)分析

為研究BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)取4個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期蕪菁的根和葉，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其表達(dá)量(圖5)。研究表明，蕪菁隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因在葉中的表達(dá)量降低，根中的表達(dá)量增加。BrrHMA2.1基因在蕪菁生長(zhǎng)18 d，葉中的表達(dá)量相對(duì)于根中較高(P< 0.05)；生長(zhǎng)36 d與18 d相比較，葉的表達(dá)量降低1倍，根的表達(dá)量增加5倍；生長(zhǎng)43 d與18 d相比較，葉的表達(dá)量降低1倍，根的表達(dá)量增加19倍；生長(zhǎng)50 d與18 d相比較，葉的表達(dá)量降低2倍，根的表達(dá)量增加15倍；BrrHMA2.2基因與BrrHMA2.1基因表達(dá)結(jié)果相似，均在蕪菁生長(zhǎng)18 d時(shí)，葉中表達(dá)量高，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，在根中的表達(dá)量高于葉(P< 0.05)。其中生長(zhǎng)43 d時(shí)，2個(gè)基因在根中的表達(dá)量最高。

圖3 BrrHMA2.1、BrrHMA2.2與擬南芥AtHMA家族氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of BrrHMA2.1, BrrHMA2.2 and Arabidopsis AtHMA family amino acid sequence

2.5 BrrHMAs基因在不同金屬脅迫下的表達(dá)分析

本實(shí)驗(yàn)采用多種金屬脅迫處理，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)BrrHMA2.1和BrrHMA2.2在不同金屬脅迫條件下的表達(dá)(圖6)。研究發(fā)現(xiàn)，不同金屬脅迫條件下，蕪菁BrrHMA2.1基因在葉中均表現(xiàn)為下調(diào)，明顯受多種金屬的抑制(P< 0.05)，根中均表現(xiàn)為上調(diào)；BrrHMA2.2在葉中均表現(xiàn)為上調(diào)，Cu2+、Na+在根中表現(xiàn)為上調(diào)，其他均為下調(diào)表達(dá)。其中，BrrHMA2.1基因在Cd2+、Cu2+、

圖中數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫(xiě)字母表示不同金屬處理相同組織在0.05水平存在顯著性的差異(P<0.05)The data in the figure is the mean ± standard error, and the different normal letters indicate that there is a significant difference at the 0.05 level for the same tissue treated by different metals(P<0.05)

Na+處理后的葉中顯著被下調(diào)表達(dá)(P< 0.05)；Mg2+、Zn2+、Na+處理后的根中顯著上調(diào)表達(dá)(P< 0.05)；BrrHMA2.2基因在Cd2+處理后的葉中和Cu2+、Na+處理后的根中顯著表達(dá)(P< 0.05)。與處理前相比，BrrHMA2.1基因Cd2+、Cu2+、Na+在處理后葉中的表達(dá)量下調(diào)至未處理時(shí)的1倍；BrrHMA2.1基因Mg2+、Zn2+、Na+在處理后根中的表達(dá)量分別上調(diào)至未處理時(shí)的11、12、13倍。BrrHMA2.2基因與處理前相比，在葉中的表達(dá)量均顯著上調(diào)，并且在Cd2+中的表達(dá)量最高上調(diào)至未處理時(shí)的5倍。在根中的Cu2+、Na+表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)，分別是對(duì)照的4倍和6倍，其他均呈現(xiàn)下調(diào)。由此推測(cè)，BrrHMA2.1基因可能參與Cd2+、Zn2+、Na+、Mg2+吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，BrrHMA2.2基因可能參與Cd2+、Na+、Cu2+的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 討 論

本研究克隆得到蕪菁中HMA2的一對(duì)同源基因，相對(duì)于擬南芥，蕪菁中HMA2基因發(fā)生了擴(kuò)增，這和已報(bào)道的其他一些基因家族成員的結(jié)果一致[28-29]。這可能是因?yàn)槭忀歼M(jìn)化歷史中發(fā)生的多倍化事件導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)或基因數(shù)目的變化[30]。在植物進(jìn)化過(guò)程中，HMA基因數(shù)量的增加可能與金屬耐性和運(yùn)輸?shù)墓δ苡嘘P(guān)。研究發(fā)現(xiàn)蕪菁BrrHMA2.1和BrrHMA2.2蛋白都定位于細(xì)胞膜上，且含有HMA2蛋白所有的保守結(jié)構(gòu)域，這表明蕪菁中HMA2基因可能和這些物種HMA2成員具有類似的功能，與擬南芥或水稻的研究結(jié)果一致[30-31]。但是由于不同植物對(duì)重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)特性有著很大差異，因此蕪菁中HMA2基因的作用機(jī)制及2個(gè)同源基因之間的作用關(guān)系值得深入研究。

由于已經(jīng)證明植物HMA基因參與多種重金屬的積累、運(yùn)輸或外排[15]，包括植物微量元素和非必需元素[32-35]，因此它們可能在維持植物礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和抵抗重金屬污染方面發(fā)揮重要作用。蕪菁吸收微量元素和重金屬Cd的能力較高[28]。因此，研究蕪菁對(duì)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制具有重要意義。其中，AtHMA2與金屬具有特別高的親和力作用[36]。AtHMA2基因在Zn2+和Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收過(guò)程中具有重要作用[17]。單獨(dú)敲除AtHMA2導(dǎo)致Zn2+從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)減少[17,30]。根據(jù)金屬依賴轉(zhuǎn)運(yùn)酶的特性表明，除了Zn2+之外，其它的Cd2+、Pb2+、Ni2+、Co2+和Cu2+等金屬離子可能被HMA2激活，這種廣泛的金屬選擇性是Zn-ATP酶常見(jiàn)的[37]。由此推測(cè)，BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因可能同樣參與Zn2+和Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，蕪菁BrrHMA2.1，BrrHMA2.2基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同金屬離子處理后在蕪菁的根和葉中均能表達(dá)。其中，隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加，2個(gè)基因的表達(dá)量逐漸增加；2個(gè)基因在Zn2+、Cd2+等金屬脅迫下可以誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

目前，還沒(méi)有蕪菁BrrHMA2.1和BrrHMA2.2基因的研究報(bào)道，本研究為后期開(kāi)展蕪菁重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BrrHMA2.1、BrrHMA2.2的生物學(xué)功能研究，深入探討蕪菁體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為蕪菁遺傳育種及提高產(chǎn)量提供新的思路。

參考文獻(xiàn):

[1] 陳美靜, 劉倩雯, 李雪妹, 等. 重金屬脅迫與植物礦質(zhì)元素交互作用的研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016,55(1): 249-251.

CHEN M J, LIU Q W, LI X M,etal. Research progress in the interaction between heavy metal stress and plant mineral elements[J].HubeiAgriculturalSciences, 2016,55(1): 249-251.

[2] 安 瓊，王麗敏，張 鵬，等. 不同鉀濃度對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27(5): 115-119．

AN Q, WANG L M, ZHANG P,etal. Effects of different potassium concentrations on the growth of maize seedlings[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2011,27(5): 115-119.

[3] 陳建軍，李金玲，趙 致，等. 鈣鎂元素缺乏對(duì)一年生何首烏塊根礦質(zhì)元素含量的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(1): 33-35．

CHEN J J, LI J L, ZHAO Z,etal. Effects of Ca and Mg deficiency on the contents of mineral elements in roots ofPolygonum[J].GuizhouAgriculturalSciences, 2014,42(1): 33-35.

[4] HACISALIHOGIU G, HART J J, WANG Y H,etal. Zinc efficiency is correlated with enhanced expression and activity of zinc-requiring enzymes in wheat[J].PlantPhysiology, 2003,131: 595-602.

[5] 張育平. 中華稻蝗對(duì)重金屬鎘的解毒機(jī)制研究[D]. 太原:山西大學(xué)，2012．

[6] BUENDIA G L, OROZCO V J, CRUZ S F,etal. Prosopis laevigata a potential chromium (VI) and cadmium (II) hyperaccumulator desert plant[J].BioresourceTechnology, 2010,101: 5 862-5 867.

[7] LUO X Q, WANG S J, ZHANG G L. Advances in the study of cadmium contaminated soil and its bioremediation[J].JournalofAgricultureandBiology, 2008,27: 357-361.

[8] XIAO C W, LUO X Y, TIAN Y,etal. Research progress of bioremediation of heavy metal cadmium pollution[J].Chemistry&Bioengineering, 2013,30: 1-4.

[9] WU Q, SU N N, CAI J T,etal. Hydrogen-rich water enhances cadmium tolerance in Chinese cabbage by reducing cadmium uptake and increasing antioxidant capacities[J].JournalofPlantPhysiology, 2015,175: 174-182.

[10] 吳志超. 高低鎘積累甘藍(lán)型油菜品種的篩選及其生化機(jī)制研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015．

[11] EHSAN S, ALI S, NOUREEN S,etal. Citric acid assisted phytoremediation of cadmium byBrassicanapusL[J].Ecotoxicology&EnvironmentalSafety, 2014,106: 164-172.

[12] KAMRAN M A, MUFTI R, MUBARIZ N,etal. The potential of the flora from different regions of Pakistan in phytoremediation: a review[J].EnvironSciPollutResInt, 2014,21: 801-812.

[13] AMNA A N, MASOOD S, MUKHTAR T,etal. Differential effects of cadmium and chromium on growth, photosynthetic activity, and metal uptake ofLinumusitatissimumin association with Glomus intraradices[J].EnvironmentalMonitoring&Assessment, 2015,187: 311.

[14] 張標(biāo)金，張祥喜，羅林廣. 與植物鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的主要基因家族[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013，32(1): 127-134．

ZHANG B J, ZHANG X X, LUO L G. Major gene families related to cadmium uptake and transport in plants[J].GenomicsandAppliedBiology, 2013,32(1): 127-134.

[15] LI D D, XU X M, HU X Q,etal. Genome-wide analysis and heavy metal-induced expression profiling of theHMAgene family inPopulustrichocarpa[J].FrontiersinPlantScience, 2015,6: 122-134.

[16] BAXTER I, TCHIEU J, SUSSMAN M R,etal. Genomic comparison of p-type ATPase ion pumps in Arabidopsis and rice[J].PlantPhysiology, 2003,132: 618-628.

[17] SATOH N N, MORI M, NAKAZAWA N,etal. Mutations in rice (Oryzasativa) heavy metal ATPase 2 (OsHMA2) restrict the translocation of zinc and cadmium[J].PlantCellPhysiology, 2012,53: 213-224.

[18] MOREL M, CROUZET J, GRAVOT A,etal.AtHMA3, AP1B-ATPase allowing Cd/Zn/Co/Pb vacuolar storage inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2009,149: 894-904.

[19] MIYADATE H, ADACHI S, HIRAIZUMI A,etal.OsHMA3, AP1B-type of ATPase affects root-to-shoot cadmium translocation in rice by mediating efflux into vacuoles[J].NewPhytologist, 2011,189: 190-199.

[20] CHAO D Y, SILVA A,etal. Genome-wide association studies identify heavy metal ATPase3 as the primary determinant of natural variation in leaf cadmium inArabidopsisthaliana[J].PlosGenetics, 2012,8(9): e1002923.

[21] VERRET F, GRAVOT A, AUROY P,etal. Overexpression ofAtHMA4 enhances root-to-shoot translocation of zinc and cadmium and plant metal tolerance[J].FebsLetters, 2004,576: 306-312.

[22] HANIKENNE M, TALKE I N, HAYDON M J,etal. Evolution of metal hyperaccumulation required cis-regulatory changes and triplication ofHMA4[J].Nature, 2008,453: 391-395.

[23] LEE S, KIM Y Y, LEE Y,etal. Rice P1B-type heavy-metal ATPase, OsHMA9, is a metal efflux protein[J].PlantPhysiology, 2007, 145: 831-842.

[24] 高虎虎，張?jiān)葡?，胡勝武，? 甘藍(lán)型油菜MADS-box基因家族的鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 植物學(xué)報(bào)，2017，52(6): 699-712．

GAO H H,ZHANG Y X, HU S W,etal. Identification and phylogenetic analysis of MADS-box gene family inBrassica[J].JournalofBotany, 2017,52(6): 699-712.

[25] 劉凱歌，齊雙慧，段紹偉，等. 甘藍(lán)型油菜BnTTG基因的功能分析[J]. 植物學(xué)報(bào)，2017，52(6): 713-722．

LIU K G, QI S H, DUAN S W,etal. Functional analysis of BnTTG1-1 gene inBrassica[J].JournalofBotany, 2017,52(6): 713-722.

[26] 賈樂(lè)東，李施蒙，許代香，等. 甘藍(lán)型油菜BnMYB80基因的生物信息學(xué)分析[J]. 植物學(xué)報(bào)，2016，52(5): 620-630．

JIA L D, LI S M, XU D X,etal. Bioinformatics analysis of BnMYB80 gene inBrassica[J].JournalofBotany,2016,52(5): 620-630.

[27] 施月婕，高 杰，趙建軍. 鹽脅迫對(duì)蕪菁種子萌發(fā)的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48(3): 487- 492．

SHI Y J, GAO J, ZHAO J J. Effect of salt stress on seed germination of turnip[J].XinjiangAgriculturalSciences, 2011,48(3): 487- 492.

[28] LI X, ZHANG X M, YANG Y,etal. Cadmium accumulation characteristics in turnip landraces from China and Assessment of their phytoremediation potential for contaminated soils[J].FrontiersinPlantScience, 2016,7: 112-124.

[29] YIN X, WANG Q L, CHEN Q,etal. Genome-wide identification and functional analysis of the calcineurin B-like protein and calcineurin B-like protein-interacting protein kinase gene families in turnip (Brassicarapavar.rapa)[J].FrontiersinPlantScience, 2017,8: 1 191.

[30] TAKAHASHI R, ISHIMARU Y, SHIMO H,etal. TheOsHMA2 transporter is involved in root-to-shoot translocation of Zn and Cd in rice[J].PlantCellEnvironment, 2012,35: 1 948-1 957.

[31] HUSSAIN D, HSYDON M J, WANG Y,etal. P-type ATPase heavy metal transporters with roles in essential Zinc homeostasis inArabidopsis[J].PlantCell, 2004,16: 1 327-1 339.

[32] KIM D, GUSTIN J L, LAHNER B,etal. The plant CDF family memberTgMTP1 from the Ni/Zn hyperaccumulator thlaspi goesingense acts to enhance efflux of Zn at the plasma membrane when expressed inSaccharomycescerevisiae[J].PlantJournal, 2004,39: 237-251.

[33] DELHAIZE E, GRUBER B D, PITTMAN J K,etal. A role for theAtMTP11 gene ofArabidopsisin manganese transport and tolerance[J].PlantJournal, 2007,51: 198-210.

[34] XU J, CHAI T Y, ZHANG Y X,etal. The cation-efflux transporterBjCET2 mediates zinc and cadmium accumulation inBrassicajunceaL. leaves[J].PlantCellReports, 2009,28: 1 235-1 242.

[35] LANG M L, HAO M Y, FAN Q W,etal. Functional characterization ofBjCET3 andBjCET4, two new cation-efflux transporters fromBrassicajunceaL[J].JournalofExperimentalBotany, 2011,62: 4 467-4 480.

[36] SHARMA R, RENSING C, ROSEN BP,etal. The ATP hydrolytic activity of purified ZntA, a Pb(II)/Cd(II)/Zn(II)-translocating ATPase fromEscherichiaColi[J].JournalofBiologicalChemistry, 2000,275(6): 3 873-3 878.

[37] ELIF E, JOSE M, ARGUELLO. ArabidopsisHMA2, a divalent heavy metal-transporting PIB-type ATPase, is involved in cytoplasmic Zn2+homeostasis[J].PlantPhysiology, 2004,136: 3 712-3 723.