戴雪梅 楊先鋒 辛士超 成鏡 彭素娜 華玉偉

摘 要 分別以橡膠樹GT1種子實(shí)生苗古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期4個不同發(fā)育階段的葉片為材料進(jìn)行原生質(zhì)體的酶解分離研究，同時分析比較不同酶組合、酶解時間和甘露醇濃度等主要因素對橡膠樹葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響，建立高效穩(wěn)定的橡膠樹葉片原生質(zhì)體分離體系，為進(jìn)行橡膠樹外源基因瞬時表達(dá)及CRISPR基因編輯等研究快速提供高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的原生質(zhì)體。結(jié)果表明：在同等條件下，變色期葉片的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最高，分別為14.8 ×107個/g FW和97.3%；其次為古銅期葉片，可達(dá)到8.6×107個/g FW和95.2%；淡綠期和穩(wěn)定期葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量非常低，活力也相對較低，分別僅有3.4 ×105個/g FW和89.5%、7.2 ×104個/g FW和80.6%。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最適合變色期葉片原生質(zhì)體分離的條件為：酶組合為2%纖維素酶+0.6%離析酶、酶解時間為6 h、甘露醇濃度為0.6 mol/L，此時橡膠樹葉肉原生質(zhì)體的產(chǎn)量可高達(dá)19.7×107個/g FW，活力約為97.6%。

關(guān)鍵詞 橡膠樹 ；葉片發(fā)育階段 ；原生質(zhì)體分離

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.011

Abstract The leaves of rubber tree （Hevea brasiliensis Mull. Arg） at the bronze phase， color-changing phase， light green phase and stable phase were used as materials for protoplast isolation. The effects of some major factors such as enzymatic combination， digestion time and concentration of mannitol on the production and viability of protoplasts were analyzed in order to establish an efficient system for protoplast isolation and provide protoplasts for transient exogenous gene expression of and CRISPR genome editing of rubber tree. The results showed that the leaves at the color-changing phase under the same isolation conditions had the highest yield and viability of mesophyll protoplasts （14.8×107 protoplasts/g FW and 97.3%， respectively）， followed by the leaves at the bronze phase （8.6×107 protoplasts/g FW and a viability of 95.2%）， while the leaves at the light green phase and stable phase had very low protoplast yield and relatively low viability （3.4×105 protoplasts/g FW and 89.5%； 7.2×104 protoplasts/g FW and 80.6%， respectively）. The single factor experimental results showed that the optimal conditions for protoplast isolation were 2% cellulase R-10+0.6% macerozyme R-10 for the enzymatic combination， 6 h for the digestion time， and 0.6 mol/L for the concentration of mannitol. Under these optimal conditions the yield of protoplasts of rubber tree leaves could be up to 19.7×107 protoplasts/g FW with viability of 97.6%.

Keywords Hevea brasiliensis Mull. Arg ； leaf development stage ； protoplast isolation

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，所產(chǎn)的天然橡膠是四大戰(zhàn)略物資之一。隨著分子生物學(xué)和功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因育種已成為多種作物種質(zhì)改良的有效途徑。中國于2016年完成較高質(zhì)量的橡膠樹全基因組測序工作，并通過基因組的分析對橡膠樹膠乳產(chǎn)量及物種適應(yīng)性提出了新的認(rèn)識[1]，對今后橡膠樹分子生物學(xué)研究及基因工程育種起了極大的推動作用。但目前橡膠樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)尚不成熟，轉(zhuǎn)化效率偏低，且由于生長周期較長，轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因無法在橡膠樹體內(nèi)得到快速的驗(yàn)證。此外，橡膠樹轉(zhuǎn)基因起始材料主要為愈傷組織和體細(xì)胞胚等多細(xì)胞組織或器官[2-3]，再生株系易產(chǎn)生嵌合體，導(dǎo)入的目標(biāo)基因在后代培育中易發(fā)生分離而難于穩(wěn)定遺傳。利用高效的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系可以快速對目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)水平和部位分析及功能的初步驗(yàn)證，且轉(zhuǎn)化后經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得的再生植株屬于單細(xì)胞起源，不存在嵌合體現(xiàn)象，可節(jié)省大量繁瑣的后續(xù)篩選工作，從而縮短培育周期、加快育種進(jìn)程。

然而目前大多利用煙草、擬南芥等異源的模式植物原生質(zhì)體對橡膠樹中克隆分離的目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)分析，無法保證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，關(guān)于利用橡膠樹自身細(xì)胞進(jìn)行外源基因瞬時表達(dá)的研究報(bào)道非常少。究其原因，在于尚未尋找到一個合適的可用于建立高效瞬時表達(dá)體系的橡膠樹原生質(zhì)體分離材料及穩(wěn)定高效的制備技術(shù)體系。雖然Zhang等[4]報(bào)道稱，針對橡膠樹熱研7-33-97實(shí)生苗淡綠期葉片，可通過酶解獲得高產(chǎn)量高活力的原生質(zhì)體，并以此建立了相對高效的橡膠樹原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系。但筆者在研究過程中采用該文獻(xiàn)描述的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，淡綠期葉片經(jīng)酶解后獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均相對較低，難以進(jìn)行下一步的基因轉(zhuǎn)化及其它應(yīng)用研究。為了解決這個問題，有必要建立一個完善的橡膠樹高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原生質(zhì)體的制備方法，用于構(gòu)建高效的橡膠樹原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系，使得從全基因組調(diào)出的一些重要基因可以通過該體系在橡膠樹體內(nèi)表達(dá)，以便對其進(jìn)行分析和功能鑒定。

本研究以最容易獲得的橡膠樹GT1種子實(shí)生苗為研究對象，分別選取古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期4個不同發(fā)育階段的葉片為起始材料，進(jìn)行原生質(zhì)體酶解分離條件的摸索和優(yōu)化，分析比較不同酶組合、酶解時間和甘露醇濃度3個主要因素對橡膠樹葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響，以建立一個穩(wěn)定高效的橡膠樹葉片原生質(zhì)體分離技術(shù)體系，為目標(biāo)基因在橡膠樹自身體內(nèi)的瞬時表達(dá)分析及功能驗(yàn)證快速提供大量高活力的原生質(zhì)體。

1 材料與方法

1.1 材料

橡膠樹GT1種子實(shí)生苗采自海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠樹種質(zhì)圃，以4個不同發(fā)育階段的葉片作為原生質(zhì)體分離的起始材料。

纖維素酶R-10、離析酶R-10均購自日本Yakult Honsha公司；PEG 4000、甘露醇、KCl、CaCl2、MES等試劑藥品均購自Sigma公司。

實(shí)驗(yàn)所用W5溶液的配制參照Yoo等[5]描述的方法，成分為：2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 葉片原生質(zhì)體的分離和純化

分別選取橡膠樹GT1種子實(shí)生苗古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期4個時期的葉片各1 g（鮮重），立刻轉(zhuǎn)入0.6 mol/L甘露醇中浸泡10 min；用吉列刀片避開主葉脈將葉片切成0.5～1 mm寬的細(xì)長條，放入含10 mL酶液（1.5%纖維素酶，0.5%離析酶，0.5 mol/L甘露醇，204 mmol/L KCl，67 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MES，0.1% BSA，pH 5.7）的100 mL三角瓶中，抽真空后置于28℃暗培養(yǎng)室，在60 r/min搖床上振蕩酶解5 h；終止反應(yīng)，用等體積的W5溶液稀釋，并依次通過250和500目的不銹鋼濾網(wǎng)；將濾液轉(zhuǎn)入50 mL圓底離心管中，以1 000 r/min離心3 min，棄上清，用W5溶液將沉淀漂洗2次，在相同條件下離心收集原生質(zhì)體并用1 mL W5溶液重懸，取少量原生質(zhì)體懸液進(jìn)行產(chǎn)量和活力的測定。

1.2.2 酶組合單因素實(shí)驗(yàn)

以上述酶解后原生質(zhì)體產(chǎn)量最高的葉片為材料（以下實(shí)驗(yàn)同），在0.6 mol/L甘露醇中浸泡10 min后用吉列刀片除去主葉脈，將其切成0.5～1 mm寬的細(xì)長條，分別轉(zhuǎn)入9種含不同濃度纖維素酶和離析酶的酶組合液中（表1）；抽真空后置于28℃暗培養(yǎng)室，于搖床上以60 r/min分別振蕩酶解5 h，過濾漂洗純化后用1 mL W5溶液重懸，分別測定原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

1.2.3 酶解時間單因素實(shí)驗(yàn)

采用上述獲得最高原生質(zhì)體產(chǎn)量的酶組合，在28℃暗培養(yǎng)條件下，于60 r/min搖床上分別對葉片切條進(jìn)行2、4、6和8 h酶解處理，過濾純化后用1 mL W5溶液重懸，比較不同酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。

1.2.4 甘露醇濃度單因素實(shí)驗(yàn)

采用最佳的酶組合，在配制酶液時分別加入0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L甘露醇，分別對葉片切條進(jìn)行酶解處理，時間為上述獲得的最佳酶解時間；過濾純化后用1 mL W5溶液重懸，比較不同滲透壓對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。

1.2.5 原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的測定

原生質(zhì)體的產(chǎn)量采用血球計(jì)數(shù)板（規(guī)格為25格×16格）進(jìn)行測定。取少量原生質(zhì)體懸液，滴入血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室中，在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)四角及中間5個中方格（共80個小方格）的原生質(zhì)體數(shù)。按照以下公式計(jì)算：原生質(zhì)體總數(shù)（個/g FW）=80個小方格原生質(zhì)體數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)。每個樣品重復(fù)3次。

原生質(zhì)體的活力采用FDA染色法[6]進(jìn)行熒光觀察鑒定。將新分離的原生質(zhì)體用0.01%的FDA染色5 min后，在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)發(fā)綠色熒光的存活原生質(zhì)體數(shù)及總原生質(zhì)體數(shù)，隨機(jī)觀察3個視野取其平均值，并采用以下公式進(jìn)行計(jì)算：原生質(zhì)體活性=（存活原生質(zhì)體數(shù)/總原生質(zhì)體數(shù)）×100%。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，用DPS 7.55進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片不同發(fā)育時期對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

從表2和圖1可以看出，古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期這4個時期的葉片在相同酶解條件下原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均存在顯著差異，其中產(chǎn)量和活力最高的是變色期葉片，分別達(dá)到14.8×107個/g FW和97.3%；古銅期葉片雖然極易被酶消化，但可能由于其比較幼嫩脆弱，在酶解過程中細(xì)胞較易破裂，導(dǎo)致活力和總體產(chǎn)量均略低于變色期葉片；而淡綠期到穩(wěn)定期葉片逐漸木質(zhì)化，細(xì)胞壁不易被酶消化，因此產(chǎn)量依次顯著降低，尤其是穩(wěn)定期葉片由于已完全硬化，酶解非常困難，而且所得原生質(zhì)體在顯微鏡下可見較多纖維碎片，細(xì)胞活力也只有80%左右。結(jié)果表明處于變色期的葉片是用來分離高產(chǎn)量高活力原生質(zhì)體的最佳起始材料。

2.2 酶組合對葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

以變色期葉片為材料，在甘露醇濃度為0.5 mol/L、酶解時間為5 h的條件下，分析比較纖維素酶和離析酶不同組合濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。從圖2可以看出，纖維素酶在葉片原生質(zhì)體的分離過程中起主要作用。隨著纖維素酶濃度的升高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量顯著增加，但當(dāng)纖維素酶濃度升高到3%時，原生質(zhì)體的活性急劇下降，導(dǎo)致原生質(zhì)體的產(chǎn)量亦顯著下降；離析酶濃度對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性也有一定的影響，在纖維素酶濃度為2%時，隨著離析酶濃度的升高原生質(zhì)體產(chǎn)量有所增加，繼續(xù)升高其濃度，產(chǎn)量變化趨勢不明顯，但活性略有所下降。最適合變色期葉片原生質(zhì)體分離的酶組合是2%纖維素酶+0.6%離析酶，此時原生質(zhì)體的產(chǎn)量可高達(dá)14.2 ×107個/g FW。

2.3 酶解時間對葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

在酶組合為2%纖維素酶+0.6%離析酶、甘露醇濃度為0.5 mol/L的條件下，將變色期葉片分別酶解2、4、6、8 h，分析比較不同酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。結(jié)果如圖3所示，酶解時間在6 h以內(nèi)時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨著酶解時間的增加顯著提高，之后呈下降趨勢；細(xì)胞活性在前6 h內(nèi)差異不明顯，均可達(dá)95%以上，之后急劇下降。綜合考慮原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力，最佳的酶解時間為6 h，此時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)到17.8 ×107個/g FW。

2.4 甘露醇濃度對葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

在酶組合為2%纖維素酶+0.6%離析酶、酶解時間為6 h、甘露醇濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的條件下對變色期葉片進(jìn)行原生質(zhì)體的分離和活性檢測。結(jié)果如圖4所示，甘露醇濃度在0.2～0.6 mol/L時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均隨著甘露醇濃度的增加而顯著升高；當(dāng)甘露醇濃度升至0.8 mol/L時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均呈現(xiàn)下降趨勢。結(jié)果表明低滲和高滲環(huán)境均不利于原生質(zhì)體的分離，酶液中最適合橡膠樹葉片原生質(zhì)體分離的甘露醇使用濃度為0.6 mol/L，此時其產(chǎn)量和活力均達(dá)到最高，分別為19.7 ×107個/g FW和97.6%。

3 討論

離體培養(yǎng)的愈傷組織、懸浮細(xì)胞、體細(xì)胞胚及植物的各個活體器官，如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等均可作為原生質(zhì)體分離的起始材料。由于獲得愈傷組織和懸浮細(xì)胞等離體組織所需的時間較長且通常在暗室培養(yǎng)，不利于研究與葉綠體相關(guān)的目標(biāo)基因的表達(dá)及定位分析，而葉片是可以最快速獲取的植物材料，且由于其含有豐富的葉綠素，新鮮的葉肉原生質(zhì)體通常具有光合成活性[7]，非常適合用來鑒定與葉綠體相關(guān)的基因功能及研究光和葉綠體作用的相關(guān)過程[8]。因此，葉片是許多植物用于分離原生質(zhì)體的首選材料。

根據(jù)發(fā)育時間及形態(tài)顏色的差異，橡膠樹葉片從萌發(fā)到成熟可劃分為A、B、C、D 4個階段[9-10]，依次命名為古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期[11]。其中古銅期、變色期和淡綠期葉片幾乎不含木質(zhì)素，但穩(wěn)定期的葉片由于木質(zhì)化而變硬[10]。不同時期的葉片經(jīng)酶解后所得原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性均有較大差別。Zhang等[4]分別以古銅期、變色期和淡綠期3個時期的葉片為起始材料進(jìn)行原生質(zhì)體的分離和活性檢測，指出淡綠期葉片經(jīng)酶解后能得到最高產(chǎn)量和活性的原生質(zhì)體，古銅期葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量最低，變色期葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量略高于古銅期葉片，但仍遠(yuǎn)低于淡綠期葉片。而本研究結(jié)果與之相差較大，數(shù)據(jù)顯示相同酶解條件下獲得最高原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的是變色期葉片，古銅期的產(chǎn)量和活性均僅略低于變色期葉片，淡綠期和穩(wěn)定期葉片的原生質(zhì)體產(chǎn)量依次顯著下降，而且這2個時期葉片分離的原生質(zhì)體在顯微鏡下可見較多細(xì)胞碎片和殘?jiān)?。表明變色期葉片是獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體的最佳來源，其次為古銅期葉片，淡綠期和穩(wěn)定期獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量不高且質(zhì)量較差，推測這是由于對橡膠樹葉片發(fā)育階段的人為劃分有誤差所致。

植物原生質(zhì)體是去除細(xì)胞壁后僅由質(zhì)膜包圍的裸露細(xì)胞，具有對外在環(huán)境敏感、體積小、單次處理量大等特點(diǎn)，且從制備到檢測的周期短，一般只需要2～3 d。因此，利用原生質(zhì)體進(jìn)行外源基因的瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于外源基因表達(dá)[12]、蛋白亞細(xì)胞定位[13]、蛋白互作[14]、啟動子分析[15]及信號傳導(dǎo)通路[16]等領(lǐng)域的研究。此外，近幾年來興起的CRISPR新型基因組編輯技術(shù)[17]，亦依賴于高效的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)技術(shù)。目前，相關(guān)研究者已分別在擬南芥[18]、煙草[19]、玉米[20]、小麥和大麥[21]、水稻[22]等重要模式植物和作物中建立了成熟的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系。在橡膠樹中，于曉玲等[23]以橡膠樹熱研7-33-97雙核期花藥誘導(dǎo)的松散愈傷組織為材料酶解分離原生質(zhì)體，采用電擊法將含有紅色熒光蛋白基因（RFP）的植物表達(dá)載體pA7-RFP轉(zhuǎn)入橡膠樹原生質(zhì)體中，并通過激光共聚焦顯微鏡觀察到個別細(xì)胞中有RFP蛋白的表達(dá)；Zhang等[4]在分析比較了古銅期、變色期和淡綠期3個時期的葉片分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性后，選擇產(chǎn)量和活力最高的淡綠期葉片原生質(zhì)體進(jìn)行GFP基因的轉(zhuǎn)化，建立了一個相對高效的橡膠樹原生質(zhì)體瞬時表達(dá)體系，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)50%以上。筆者也嘗試了對橡膠樹4個時期葉片分離的原生質(zhì)體分別進(jìn)行GFP基因的轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示，從變色期葉片中分離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性最高，其轉(zhuǎn)化效率也最高（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。由此可見，原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化效率不僅與材料來源有關(guān)，而且與其產(chǎn)量和活性呈正相關(guān)。

用于植物原生質(zhì)體分離的酶主要有纖維素酶、半纖維素酶、離析酶、果膠酶、蝸牛酶等。所用酶種類和酶濃度均隨著物種及酶解材料的不同而略有差異。葉片原生質(zhì)體的分離大多采用纖維素酶和離析酶，本研究在前人研究基礎(chǔ)上對這2種酶的最適濃度進(jìn)行了摸索。同時，對影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的另外2個重要因素即酶解時間和甘露醇使用濃度進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一個穩(wěn)定高效的橡膠樹葉片原生質(zhì)體制備技術(shù)體系，可為目標(biāo)基因的瞬時表達(dá)研究及功能分析快速提供大量高活力的原生質(zhì)體。

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