皮 卓，聶義丹，陳 鵬，袁守軍，王 毅（.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿科，新疆烏魯木齊8300；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京00850；3.南華大學(xué)，湖南衡陽(yáng)400）

腎細(xì)胞癌是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80%～90%，是泌尿系常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。腎癌的治療方式主要有手術(shù)切除、免疫治療、分子靶向藥物治療等。目前分子靶向治療是中晚期腎癌重要的治療方案，但多重耐藥成為限制分子靶向藥物提高晚期腎癌患者緩解率和無(wú)進(jìn)展生存率的主要原因。近年來(lái)，不同作用靶點(diǎn)的分子靶向藥物、化療藥物與分子靶向藥物的聯(lián)合研究備受關(guān)注，以期提高藥效，延緩腫瘤耐藥性的出現(xiàn)。

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)等的根源是腫瘤干細(xì)胞。臨床上常用的抗腫瘤藥物可能對(duì)腫瘤中快速增殖及分化大部分腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，但腫瘤干細(xì)胞可以使腫瘤再生，導(dǎo)致治療失敗。該理論也可以解釋索拉非尼在腎癌治療初期有效，但無(wú)法根除腫瘤，最終出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。GUP?TA等[2]在對(duì)16000多種化合物進(jìn)行高通量篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鹽霉素可以選擇性地降低乳腺癌干細(xì)胞的活性，相關(guān)研究也證實(shí)鹽霉素對(duì)肺癌、胃癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤干細(xì)胞均具有明顯的殺傷作用[3?6]，這也讓鹽霉素具備成為抗腫瘤藥物的潛力[7]?；谀[瘤干細(xì)胞理論，本研究將鹽霉素與索拉非尼聯(lián)合使用，探討鹽霉素能否增強(qiáng)索拉非尼對(duì)人腎癌細(xì)胞KCC853的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試細(xì)胞株 人腎癌細(xì)胞KCC853，購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.1.2 試藥與主要試劑 鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品（規(guī)格：每支0.2 g，由山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)提供；索拉非尼原料藥，批號(hào)：475207?59?1，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所9室惠贈(zèng)，純度為99.81%；RPMI1640（Gibco BRL公司）；二甲基亞砜（DMSO）、四氮唑藍(lán)、Annexin Ⅴ、PI（Sigma?Aldrich 公司）。

1.1.3 儀器 Multiskan Ascent酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo?Labsystem公司）；CO2培養(yǎng)箱（B16HF，德國(guó)賀立氏儀器公司）；倒置顯微鏡（XDS?1B，重慶光電公司）；渦旋振蕩儀（德國(guó)Eppendorf公司）；流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD/Beckman/德國(guó) Guava公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 將人腎癌細(xì)胞KCC853加入RPMI?1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10%小牛血清），置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞增殖至80%密度時(shí)換液、傳代。取鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品索拉非尼19.2 mg溶于200μL DMSO，培養(yǎng)基稀釋至20 mL，-20℃保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)培養(yǎng)基稀釋?zhuān)珼MSO終濃度低于0.5%，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖基本無(wú)影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)6組：空白對(duì)照組、鹽霉素組、索拉非尼組、索拉非尼+鹽霉素（索∶鹽）2∶1、1∶1、1∶2比例合用組。受試藥單用濃度梯度為0.375、0.750、1.500、3.000、6.000、12.000、24.000、48.000、96.000μg/mL共9個(gè)濃度；合用組：索拉非尼終濃度分別為：0.094、0.188、0.375、0.750、1.500、3.000、6.000、12.000、24.000、48.000 μg/mL，鹽霉素濃度按比例確定。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 （1）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞每孔104個(gè)接種于6孔板，24 h后加入藥物，終濃度：鹽霉素（6μg/mL）、索拉非尼（6μg/mL）、索拉非尼+鹽霉素（6μg/mL+6μg/mL）；（2）繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，無(wú)乙二胺四乙酸胰酶消化，1000 r/min離心并收集細(xì)胞；（3）磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，離心取上清，加入100μL Binding Buffer，避光條件下分別加入2μL AnnexinⅤ和 2μL PI，繼續(xù)孵育 30 min，300μL Binding Buffer處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間資料比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 鹽霉素與索拉非尼聯(lián)合用藥效應(yīng)評(píng)價(jià) 鹽霉素與索拉非尼對(duì)人腎癌KCC853細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制具有濃度依賴(lài)性，兩藥合用可減少治藥劑量。兩藥單用和不同比例合用組對(duì)KCC853細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率見(jiàn)表1、2。

表1 兩藥單用對(duì)人腎癌KCC853生長(zhǎng)的抑制作用

表2 兩藥合用對(duì)人腎癌KCC853生長(zhǎng)的抑制作用

續(xù)表2 兩藥合用對(duì)人腎癌KCC853生長(zhǎng)的抑制作用

ORIGIN 8.0軟件中l(wèi)ogistic程序，擬合即量效曲線及函數(shù)方程見(jiàn)圖1。

表3 各組受試藥濃度及CI

圖1 受試藥物單用和不同比例合用的量效關(guān)系曲線及函數(shù)方程

圖2 受試藥物對(duì)KCC853細(xì)胞凋亡的影響

續(xù)表3 各組受試藥濃度及CI

2.2 受試藥物對(duì)KCC853細(xì)胞凋亡的影響 鹽霉素與索拉非尼能明顯促進(jìn)KCC853細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞比例分別為49.03%、48.60%；聯(lián)合用藥組凋亡細(xì)胞比例達(dá)60.57%（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討 論

分子靶向藥物主要是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特征性改變作為靶點(diǎn)，在抗腫瘤治療中具有高效、低毒的特點(diǎn)。索拉非尼是多靶向性腫瘤治療藥物，一方面，索拉非尼可選擇性抑制RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路中絲氨酸/蘇氨酸激酶，使相關(guān)基因表達(dá)降低，直接減少腫瘤細(xì)胞的增殖；另一方面，索拉非尼還可通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（VEGFR），阻斷腫瘤新生血管形成，使腫瘤細(xì)胞得不到充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)而達(dá)到限制腫瘤發(fā)展的目的[11?15]。索拉非尼是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的第1個(gè)用于治療腎癌的分子靶向藥物，用于治療復(fù)發(fā)和由于內(nèi)科或外科原因無(wú)法手術(shù)切除的晚期腎癌[16]。研究表明，晚期腎癌患者接受索拉非尼治療后，可明顯延長(zhǎng)生存期[17]。TAFRESHI等[18]也證實(shí)了索拉非尼作為一線治療藥物在各種病理類(lèi)型的轉(zhuǎn)移性或手術(shù)后腎癌都有很好的耐受性和臨床效果。分子靶向藥物的使用使腎癌的治療效果得到了巨大改善。然而，腎癌發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜，單獨(dú)使用索拉非尼很難完全控制腫瘤的進(jìn)展；而索拉非尼是腫瘤抑制劑而非殺傷劑，停藥后腫瘤容易進(jìn)展，且長(zhǎng)時(shí)間治療后易產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題都極大限制了索拉非尼的療效。

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤異常增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)等的根源，該理論為腫瘤發(fā)生機(jī)制研究開(kāi)辟了一個(gè)新的領(lǐng)域，也為腫瘤治療提供了新的思路，腫瘤干細(xì)胞成為腫瘤治療的靶細(xì)胞。研究表明鹽霉素能減少、延緩腫瘤細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，并誘導(dǎo)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡[19?20]。

本實(shí)驗(yàn)中，鹽霉素與索拉非尼對(duì)KCC853細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用，表現(xiàn)出顯著的劑量依賴(lài)性。計(jì)算不同比例合用時(shí)不同抑制率（ED30、ED50、ED70、ED90）的CI，鹽∶索=2∶1 合用，抑制率為 ED30、ED50、ED70和ED90時(shí)的CI分別為 1.1954、1.0962、1.0540、0.9573；鹽∶索=1∶1 合用，抑制率為 ED30、ED50、ED70和 ED90時(shí)CI分別為 0.7972、0.8548、0.9443、1.0372；鹽∶索=1∶2合用，抑制率為 ED30、ED50、ED70和 ED90時(shí)CI分別為0.8440、0.8212、0.8492、0.9328?？梢钥闯?，鹽霉素與索拉非尼按上述比例聯(lián)合使用表現(xiàn)出良好的相加和協(xié)同效應(yīng)，即鹽霉素可以增強(qiáng)索拉非尼對(duì)KCC853細(xì)胞增殖的抑制作用。流式細(xì)胞檢測(cè)受試藥物對(duì)KCC853細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)表明，鹽霉素與索拉非尼能明顯促進(jìn)KCC853細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞比例分別為49.03%、48.60%；聯(lián)合用藥組凋亡細(xì)胞比例達(dá)60.57%（P＜0.05），鹽霉素可增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)KCC853凋亡的作用。

鹽霉素是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤干細(xì)胞有殺傷作用的藥物，具有成為新的、有效的抗腫瘤藥物的潛力；索拉非尼是一種多靶向藥物，具有低毒性特點(diǎn)，而這種目標(biāo)治療方法也是未來(lái)腫瘤治療的新方向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，鹽霉素可增強(qiáng)索拉非尼對(duì)人腎癌細(xì)胞KCC853增殖的抑制作用及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，鹽霉素與索拉非尼組合有可能成為腎癌治療的一種組合并用于臨床工作。

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