★ 張涵 索緒斌 張云凌* 姚琳 許慶瑞 張樹明 王偉明

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院 哈爾濱 150036；2.廣東藥科大學 廣州 510006)

肺炎支原體(mycoplasma pneumonia, MP)是引發(fā)社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的主要病原體之一，其引發(fā)的支氣管炎或者肺炎，不僅常見于嬰幼兒，也見于成人[1]。因其病程較長，且可引發(fā)哮喘及肺外癥狀，越來越受到學者們的關(guān)注。其發(fā)病機制可能與細胞黏附、社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合癥毒素破壞及機體免疫異常有關(guān)[2-5]。NLRP3炎性體是一種細胞內(nèi)模式識別受體，研究表明，肺炎支原體可被NLRP3識別，觸發(fā)機體的固有免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)，與肺炎支原體肺炎的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6]。清熱止咳方(芩百清肺濃縮丸)是一種治療肺炎支原體感染的中藥復方，實驗研究表明，其抗肺炎支原體肺炎與調(diào)節(jié)NLRP3炎性體有一定關(guān)系[7]。本文旨在探討其對MP感染模型小鼠肺組織NLRP3 炎性體mRNA表達及肺泡灌洗液中IL-18分泌動態(tài)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 實驗動物 SPF級BALB/c小鼠，6～8周，全部為雌性，購自中山大學動物實驗中心，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心負壓SPF級動物房；動物合格證號為SCXK (粵) 2011-0029，許可證號為SYXK (粵) 2014-0136。

1.1.2 菌株 肺炎支原體標準菌株(ATCC-15531)，為本實驗室保存。

1.1.3 藥物及試劑 清熱止咳方(每1g含生藥2.5g)，黑龍江省中醫(yī)藥科學院中藥研究所制備，制備方法同前[7]；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit及SYBR Premix Ex Taq 購自TaKaRa公司；NLRP3、ASC、Caspase-1引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；IL-18 ELISA試劑盒購自ebioscience公司。

1.1.4 主要儀器 CFX96熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；3k-20z型高效冷凍離心機，1300 SERIES A2二級生物安全柜，美國 thermo公司；GEN ios pro酶聯(lián)免疫檢測儀，瑞士NAVO公司。

1.2 方法

1.2.1 肺炎支原體培養(yǎng) 將凍存的MP標準菌株用PPLO完全培養(yǎng)液復溶，將其置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液變橙黃色時傳代。把處于對數(shù)生長期的MP，行顏色改變單位(CCU)定量并分管凍存，用時調(diào)至所需濃度。

1.2.2 分組、接種MP及給藥 96只雌性BALB/c小鼠，隨機分為正常對照組、MP組、羅紅霉素組(50mg/Kg)、清熱止咳方組(3.3g/Kg)，每組24只，各組小鼠分籠飼養(yǎng)，其中正常對照組小鼠與其他組小鼠分房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境和條件均一致。各組小鼠，均用乙醚麻醉，參照文獻方法[9]，滴鼻法建立肺炎支原體感染小鼠模型。正常對照組小鼠同法用等容量的PPLO代替MP菌液滴鼻。滴鼻后第1d，羅紅霉素組及清熱止咳方組開始給藥，給藥容量為10 mL/Kg，連續(xù)給藥14d。模型組及正常對照組灌服相同容量蒸餾水。

1.2.3 標本的采集及保存 分別于MP感染模型建立后第7d、14d及28d，每組隨機取出小鼠8只，頸椎脫臼法處死，并用75%乙醇消毒，在生物安全柜內(nèi)分離氣管，結(jié)扎右主支氣管，氣管插管，從氣管插管處慢慢注入0.5mL 4℃預(yù)冷的PBS溶液，30s 后緩慢的抽出，此步驟重復三次，合并BALF，4℃ 3000rpm離心10min，分離上清，于-80℃保存，備做ELISA；分離左肺，-80℃凍存，備提RNA。

1.2.4 NLRP3、ASC、caspase-1mRNA相對表達量檢測 常規(guī)方法提取各組小鼠左肺的RNA，并測定濃度。參照試劑說明書進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增，NLRP3、ASC、caspase-1mRNA引物序列及擴增條件參見文獻[7]。用2-ΔΔCt法分析PCR產(chǎn)物的相對定量。

1.2.5 IL-18檢測 用ELISA方法測定，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 清肺止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1mRNA相對表達量的動態(tài)變化 與正常對照組比較，感染后7d、14d模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達量均顯著上調(diào)(P<0.01)；感染后28d模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達量無明顯變化，與正常對照組比較，沒有顯著性差異(P>0.05)；清熱止咳方組給藥后7d、14d NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達量均下降，與模型組比較，差異有顯著性(P<0.05)。給藥后28d清熱止咳方組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA相對表達量無明顯變化，與模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)。見表1-3。

表1 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織NLRP3 mRNA表達的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

表2 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織ASC mRNA表達的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

表3 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠肺組織caspase-1 mRNA表達的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠BALF IL-18的影響 MP感染后7d、14d，模型組小鼠BALF中IL-18分泌量增加，與正常對照組比較，差異有顯著性(P<0.01)；感染后28d模型組小鼠BALF中IL-18分泌量稍有增加，但與正常組比較，無見顯著性差異(P>0.05)。給予清肺止咳方 7d、14d，小鼠BALF中IL-18分泌量減少，與模型組比較，差異有顯著性 (P<0.05，P<0.01)。清熱止咳方給藥14d，再停止給藥14d，與模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 清熱止咳方對MP感染BALB/c小鼠BALF IL-18分泌的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

NOD樣受體蛋白3即NLRP3炎性體是由NLRP3、ASC、Caspase-1組成的一種多蛋白復合物，屬于胞內(nèi)識別受體，它在巨噬細胞、樹突狀細胞等多種細胞中表達，在多種感染性及非感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮作用[8-9]。

研究表明，細胞感染肺炎支原體后，活性氧以及肺炎支原體特有的社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素均可被NLRP3炎性體識別，并激活NLRP3，通過與銜接蛋白ASC作用，活化caspase-1，進而裂解無活性的pro-IL-1β，將其剪切為成熟的IL-1β，并介導一系列炎癥反應(yīng)，在肺炎支原體肺炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[6,10]。

本研究通過MP滴鼻法建立BALB/c小鼠感染模型，通過體內(nèi)實驗進一步動態(tài)觀察了NLRP3炎性體相關(guān)基因及IL-18在MP感染小鼠肺組織或BALF的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠接種MP 7d，NLRP3炎性體相關(guān)基因表達上調(diào)，BALF中IL-18分泌明顯增加；感染14d NLRP3炎性體相關(guān)基因表達及BALF中IL-18分泌雖較7d下降，但還高于正常對照組，即炎癥有所減退；感染28d，NLRP3炎性體相關(guān)基因表達及BALF中IL-18分泌無明顯變化，即炎癥基本消失。其中，NLRP3炎性體相關(guān)基因表達的變化趨勢與其相關(guān)蛋白表達的變化趨勢基本一致[7]。前期體外試驗結(jié)果顯示，MP感染RAW264.7細胞后，細胞上清液IL-18的分泌量未有明顯變化，但本文整體動物試驗結(jié)果表明，IL-18在肺炎支原體感染初期和中期分泌增加，感染后期分泌趨于正常，可能是由于體外試驗中選取的時間點不同，抑或由于體外試驗脫離了體內(nèi)試驗的內(nèi)環(huán)境，故兩者結(jié)果不甚一致，具體原因有待于進一步研究[11]。

清熱止咳方是治療肺炎支原體感染的中藥復方，方中以黃芩為君藥，以其苦寒之性，清泄肺火；百部為臣藥，甘、苦、微溫，可潤肺止咳；地龍性寒、味咸，可清熱、止喘；桔梗味苦、辛、性平，可宣肺、利咽、祛痰、排膿，并輔以麥冬、紫菀，全方共奏清熱解毒、潤肺止咳的功效。前期體外實驗研究表明，清熱止咳方含藥血清能降低MP感染小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞NLRP3炎性體相關(guān)基因的相對表達量并減少肺泡灌洗液IL-1β的分泌，本研究通過體內(nèi)實驗，從NLRP3炎性體相關(guān)基因表達變化的角度探討其治療肺炎支原體感染的作用機制。結(jié)果表明，給予中藥復方清熱止咳方7d、14d后能下調(diào)MP模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達及BALF中IL-18的分泌。即清熱止咳方可能通過抑制NLRP3炎性體相關(guān)基因表達而抑制相關(guān)炎性細胞因子IL-18的分泌來發(fā)揮對肺炎支原體感染的治療作用。

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