張曉沖，戴勝，曹井相

(1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖張恒春醫(yī)藥有限公司銷售部，安徽 蕪湖 241006)

藥用金銀花又名雙花、忍冬花，為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花。種植及應(yīng)用歷史悠久，是傳統(tǒng)、常用中藥材。具有清熱解毒、宣散風熱等功效[1]。我國是金銀花的重要產(chǎn)地之一，多地都可種植，其中山東、河北、河南是較出名的三大產(chǎn)地。近年來金銀花的需求量不斷攀升，而安徽省蕪湖市的氣候也非常適合種植金銀花，因此選用蕪湖產(chǎn)的金銀花進行了含量測定?，F(xiàn)有文獻對安徽蕪湖產(chǎn)地金銀花質(zhì)量研究分析較少，為了客觀評價、充分利用安徽蕪湖產(chǎn)地藥材資源，并有效控制藥材質(zhì)量，根據(jù)2015版《中國藥典》第一部[2]，運用HPLC法測定了金銀花中有效成分綠原酸含量，對安徽蕪湖產(chǎn)金銀花藥材質(zhì)量進行了初步研究，為蕪湖產(chǎn)金銀花質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Agilent Technologies 1260 (美國安捷倫公司，二元泵，自動進樣器，DAD紫外檢測器)；色譜柱(Agllent HC-C18,5 μm,4.6×250 mm)；XL-130多功能粉碎機(永康市小寶電器有限公司，31000 r/min，650 W) ；FA1204N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；KH3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Sigma 2-16KL高速離心機(德國Sigma公司)；AP-01P真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；基因型 1850A摩爾純水機(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)。

綠原酸(質(zhì)量分數(shù)99.39%，批號 17030620)，對照品由北京標準物質(zhì)網(wǎng)和北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院聯(lián)合研制。甲醇(色譜純，美國TEDIA,16085016);乙腈(色譜純，美國TEDIA, 16085016)；磷酸(色譜純，上海展云化工有限公司，批號160815)；超純水(實驗室制備)。金銀花采集自安徽蕪湖丫山、蕪湖安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥園、蕪湖安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校草場，購買的為山東平邑產(chǎn)金銀花，共8個批次。經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等專科學校李林華講師鑒定，為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agllent HC-C18,5μm,4.6×250mm，柱溫30℃[3]，波長為327nm[4]，流速為1mL/min，進樣量20μL，以乙腈(A)-0.4%磷酸(B)為流動相洗脫[5]。理論塔板數(shù)不低于3000。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 標準品溶液的制備。取綠原酸標準品5.7mg，至于5mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1.14mg/mL的對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備。取干燥、粉碎過的金銀花粉末(過60目篩)約0.5 g，精密稱定，放入碘量瓶中，精密加入50%甲醇25 mL稱定質(zhì)量，超聲處理30 min[6]，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足損失，離心10 min，12000 r/min，取上清液濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm一次性過濾器，濾液即為供試品溶液。采集及購買的金銀花來源詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

將對照品溶液稀釋2、4、8、16、32、64倍，搖勻，按照上述色譜條件進樣，并記錄色譜峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并線性回歸?；貧w方程及線性范圍見圖1。Y=33784x+122,R2=0.9995,R=0.9997。線性范圍8.9～570 μg。結(jié)果表明，對照品線性關(guān)系良好。

2.2 精密度考察

精密吸取對照品溶液，按照2.1項下色譜條件下重復(fù)進樣6次，進樣20μL，以對照品峰面積進行計算，RSD為0.11 %[7]。結(jié)果表明，對照品精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取待測金銀花LJT1號為供試品溶液，按照上述2.1項下的色譜條件，分別在2、4、6、8、12、24h進樣[8]，測定綠原酸的峰面積RSD為1.38 %，表明樣品液在24h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果表明，對照品穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性實驗

取待測金銀花LJT1號粉末約0.1g，平行稱定3份，按照上述2.2.2項下方法操作，制備供試品溶液6份，每份精密吸取20μL，按照2.1項下色譜條件測定有效成分綠原酸的質(zhì)量分數(shù)的RSD為1.92%。結(jié)果表明，對照品重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率

取金銀花LJT1號粉末6份，每份約0.5g，精密稱定，每份加入相同量的綠原酸對照品，按照2.1項下條件測定，平均回收率為103.15%，RSD為1.97%[9]。結(jié)果表明，對照品回收率良好。

2.6 樣品測定

取不同批號的金銀花藥材約1.0g，精密稱定，按2.2.2項下方法[10]、條件操作，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，并計算綠原酸的質(zhì)量分數(shù)[11]，結(jié)果見圖2和表2。綠原酸標準品HPLC圖見圖3。

表1 金銀花的來源

表2 金銀花藥材中有效成分的測定結(jié)果

圖1 綠原酸標準品標準曲線

圖2 金銀花混合樣品在波長327nm下HPLC圖

圖3 綠原酸標準品在波長327nm下HPLC圖

3 結(jié)論與討論

3.1 提取溶劑的選擇：參照2015版《中國藥典》金銀花含量測定項下的樣品處理方法，對比了水、純甲醇、50%甲醇作為溶劑，經(jīng)過篩選，表明以50%甲醇為溶劑效果最好。參考文獻后，采用了超聲提取法進行提取。

3.2 本實驗對流動相進行了篩選：通過對純甲醇，甲醇-水和乙腈-水的篩選，發(fā)現(xiàn)乙腈-水的洗脫效果更理想，為抑制峰的拖尾，加入冰醋酸和磷酸進行篩選，結(jié)果表明,以乙腈(A)-0.4%磷酸(B)為流動相峰型較好。

3.3 本次實驗測定了購買的金銀花(山東平邑產(chǎn))中金銀花中綠原酸的含量，和在蕪湖丫山和安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥園采摘的金銀花2個產(chǎn)地不同批次的金銀花中綠原酸的含量，其中丫山產(chǎn)(野生)金銀花中綠原酸含量均高于藥典規(guī)定含量(1.5%)，平均含量為2.1%；安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥園及藥園外采摘的金銀花有效成分含量較低，與該藥材為人工栽培的改良后的金銀花品種有關(guān)。

[1]陳會良，張瑩，陳文娥. 不同產(chǎn)地金銀花抑菌效果的比較研究[J].安徽科技學院學報,2015,29(04):36-38.

[2]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:221.

[3]邢志霞,韓永成,劉偉,等.UHUPLC和HPLC法對比測定不同產(chǎn)地金銀花藥材中綠原酸的含量[J].遼寧中醫(yī)雜志,2014,41(05):992-993.

[4]馮煜.對不同產(chǎn)地金銀花原藥材質(zhì)量的研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2010,24(06):34-35.

[5]李淼,王永香,孟謹,等.HPLC法測定金銀花中綠原酸等8種成分的量[J].中草藥,2014,45(07):1006-1010.

[6]辛華,豐杰,程若敏,等.HPLC測定不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷 [J].中國實驗方劑學雜志,2011,17 (02) : 60-63.

[7]解世全,王帥,孟憲生,等.不同產(chǎn)地金銀花質(zhì)量評價 [J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(05) :80-83.

[8]李斌.山東產(chǎn)金銀花藥材現(xiàn)代質(zhì)量的應(yīng)用研究[D].濟寧：山東大學,2011:60-67.

[9]劉敏彥,高淑麗, 劉麗華, 等. HPLC法同時測定不同產(chǎn)地金銀花和山銀花中6種有機酸成分[J]. 中草藥, 2013,36 (02) :196-198.

[10]韓永成,劉偉, 陳寧, 等. 不同產(chǎn)地金銀花藥材的UPLC指紋圖譜分析 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2014,20 (02) : 67-69.

[11]趙軍峰,馬麗蘋, 張彬, 等. 金銀花HPLC指紋圖譜的建立 [J]. 中國食品學報, 2015,15 (02) : 178-184.