王中正

摘 要：目的：用ELISA方法檢測(cè)來(lái)自安徽銅陵市、鳳陽(yáng)縣及蚌埠市養(yǎng)殖場(chǎng)所采集的91份羊與91份豬的血清中甲型流感陽(yáng)性抗體，以確定其中陽(yáng)性血清和其所占總量中的比例。方法：采集的樣品在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過冷凍離心機(jī)來(lái)分離血清，并且用ELISA法對(duì)這些血清樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，以此檢測(cè)豬和羊血清中甲型流感的抗體水平。結(jié)果：在91份羊血清樣品中檢測(cè)到3份甲型流感陽(yáng)性抗體，占血清總數(shù)的3.3%；在91份豬血清樣品中檢測(cè)到21份甲型流感陽(yáng)性抗體，占血清總數(shù)的23.1%。結(jié)論：說明在安徽地區(qū)，甲型流感屬部分感染且在豬中的感染率高于羊。

關(guān)鍵詞：流感病毒；ELISA試劑盒；血清抗體

中圖分類號(hào) S858.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）02-0084-04

Abstract：Objective：Detecting the influenza A antibody in the serum samples which collected from 91 goats and 91 swine in Tongling，Bengbu and Fengyang of Anhui Province with ELISA method，so as to determine the existence and prevalence of positive serum in the total.Methods：Serum samples were collected with centrifuging in the laboratory，and detect the antibody levels of H1N1 flu in swine and goats' serum with ELISA method.Results：3 serum samples were influenza A antibody positive detected from 91 goats serum samples，accounting for 3.3% in the total，while 21 influenza A antibody positive were detected from 91 swine serum samples which account for 23.1%.Conclusion：There was some prevalence of influenza A in Anhui Province，and the positive rate of serum in swine was higher than in goat.

Key words：Influenza virus；ELISA kit；Serum antibody

甲型流感病毒可以感染多種家畜和家禽，曾在世界各地都有發(fā)生。2007年，菲律賓布拉干省及邦板牙部分豬場(chǎng)后院發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒，引起全國(guó)“紅色警報(bào)”[1]；而在我國(guó)，1957年2月首次發(fā)現(xiàn)于中國(guó)貴州西部；1977年5月在我國(guó)丹東、鞍山和天津再度發(fā)現(xiàn)新甲型（H1N1），2個(gè)月后從北向南擴(kuò)散并迅速傳遍全國(guó)。甲型流感的不斷暴發(fā)，已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外的重視，不少實(shí)驗(yàn)對(duì)其結(jié)構(gòu)、防治、流行特點(diǎn)等做出研究。流感病毒所致病癥的差異是因病毒基因的組成不同所致，根據(jù)核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（MP）的不同，分為3個(gè)類型，即甲、乙、丙型。其中，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，其主要是通過空氣、唾液等傳播，具有傳染力強(qiáng)，傳播速度快等特點(diǎn)[2]。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H有15個(gè)亞型（H1～H15），N有9個(gè)亞型（N1～N9）。其中感染人類的亞型有H1N1、H2N2、H3N2[3]，其他亞型可感染禽類或哺乳動(dòng)物。

甲型流感病毒對(duì)各個(gè)年齡、性別和品種的豬、羊都有一定的感染能力，并且有明顯的季節(jié)性，天氣多變的秋末、早春和寒冷的冬季易發(fā)生[4]。該病初期突然發(fā)熱，體溫升高達(dá)40～41.5℃，精神不振，食欲減退或廢絕，常常橫臥在一起，呼吸困難，劇烈咳嗽，呈腹式呼吸，有犬坐姿勢(shì)，夜里可聽到病豬哮喘聲，個(gè)別病豬關(guān)節(jié)疼痛。如果在發(fā)病期治療不及時(shí)，則易并發(fā)支氣管炎、肺炎和胸膜炎等，病死率大大增加[5]。母豬在懷孕期感染，產(chǎn)下的仔豬在產(chǎn)后2～5d發(fā)病很重，有些在哺乳期及斷奶前后死亡。病死剖檢可見喉、氣管及支氣管充滿含有氣泡的黏液，黏膜充血，腫脹，時(shí)而混有血液，肺間質(zhì)增寬，淋巴結(jié)腫大，充血，脾腫大，胃腸黏膜有卡他出血性炎癥，胸腹腔、心包腔蓄積含纖維素物質(zhì)的液體。

目前針對(duì)甲型流感病毒，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)包括，病毒分離培養(yǎng)、血凝抑制（HI）與血凝（HA）試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)等。其中，作為檢測(cè)病毒“金標(biāo)準(zhǔn)”的分離培養(yǎng)，由于其培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，需要一定的培養(yǎng)技術(shù)而未廣為使用；至于分子生物學(xué)檢測(cè)，大多都是針對(duì)不同亞型的特異檢測(cè)方法，對(duì)篩選所有甲型流感病毒具有一定的局限性；而免疫膠體金技術(shù)主要應(yīng)用于暴發(fā)疫情初篩大量病例的快速檢測(cè)，但靈敏度較低，檢出率不高，常常受到限制[6]。本次所采用的ELISA方法敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速高效、便于大規(guī)模檢測(cè)。據(jù)介紹，ELISA是Engvall等在1971年所建立的一種檢測(cè)方法，以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種檢測(cè)技術(shù)。常規(guī)的ELISA測(cè)定方法分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法[7]。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，因該技術(shù)的不斷改進(jìn)，又形成了很多分析方法，這些方法，有檢測(cè)抗原的，如測(cè)定病毒和血清抗體；有單抗介導(dǎo)的，有多抗介導(dǎo)的，還有的利用分子生物學(xué)為基礎(chǔ)能夠鑒別疫苗株和野毒株，在靈敏度、特異性、操作方便及快速高效等方面都有改進(jìn)。除在生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，還應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、畜牧業(yè)和食品加工業(yè)等。

鑒于甲型流感病毒的抗原易變性和傳播速度快，對(duì)甲型流感的檢測(cè)和防控造成很大困難，甚至嚴(yán)重威脅動(dòng)物和人類的健康[8]。因此，本試驗(yàn)主要用針對(duì)甲型流感所有亞型的ELISA試劑盒檢測(cè)多地區(qū)豬和羊血清中甲型流感抗體水平，及時(shí)了解甲型流感的流行狀況，為該病的綜合防控和檢測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 采自安徽省銅陵市，安徽省蚌埠市及滁州市鳳陽(yáng)縣養(yǎng)殖場(chǎng)的豬、羊的血清。其中豬血清來(lái)源于3家養(yǎng)殖場(chǎng)、羊血清采自1家養(yǎng)殖場(chǎng)。各地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)血清加樣的順序：地區(qū)1：G（001-091）S（1-40）、地區(qū)2：S（41-77）、地區(qū)3：S（78-91）。

1.1.2 儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀（生產(chǎn)廠家：京奕瑞祥科技有限公司）、抗凝管（生產(chǎn)廠家：山東奧塞特醫(yī)療器械有限公司）、冷凍離心機(jī)（生產(chǎn)廠家：上海赫田科學(xué)儀器有限公司）、離心管（生產(chǎn)廠家：山東萬(wàn)吉塑料科技有限公司）、5mL注射器。

1.1.3 主要試劑 ELISA試劑盒（生產(chǎn)廠家：北京愛德士元亨生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 從銅陵市、鳳陽(yáng)縣和蚌埠市采集豬和羊的抗凝血各91份，分別來(lái)源于3家地市級(jí)定點(diǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，樣品送至實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行離心，分離血清。

1.2.2 ELISA檢測(cè) 采集的血清用針對(duì)甲型流感的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.1 測(cè)定方法 （1）取出抗原包被板并在記錄表上標(biāo)記好被檢樣品的位置；（2）在兩孔中分別加入100μL未稀釋的陰性作為對(duì)照；（3）在兩孔中分別加入100μL未稀釋的陽(yáng)性作為對(duì)照；（4）將100μL稀釋好的被檢樣品加入相對(duì)應(yīng)的孔中；（5）置于18～26℃孵育60min；（6）每孔加約350μL的洗滌液進(jìn)行洗板，共需洗滌3～5次；（7）每孔加100μL酶標(biāo)抗體；（8）置于18～26℃孵育30min；（9）重復(fù)第六步；（10）每孔加100μL的TMB底物液；（11）再置于18～26℃孵育15min；（12）每孔加100μL的終止液終止反應(yīng)；（13）酶標(biāo)空氣調(diào)0；（14）測(cè)定各孔在650nm波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)（650）。

1.2.2.2 結(jié)果判定 只有陰性對(duì)照平均吸光度A（650）大于或等于0.600，陽(yáng)性對(duì)照的平均值S/N小于0.50，該檢測(cè)結(jié)果才能成立。如果出現(xiàn)不成立的結(jié)果，首先應(yīng)該看操作是否存在問題，并重新檢測(cè)。檢測(cè)樣品中是否含有A型流感病毒的抗體由該樣品的測(cè)定值與陰性對(duì)照平均值的比例（S/N）決定：S/N小于0.60，判為A型流感病毒抗體陽(yáng)性，S/N大于或等于0.60，判為A型流感病毒抗體陰性，具體加樣如表1和表2所示。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)處理 （1）陰性對(duì)照平均值（NCx）=[孔1A（650）+孔2A（650）]/2；（2）陽(yáng)性對(duì)照平均值（PCx）=[孔3A（650）+孔4A（650）]/2；（3）S/N比值=樣品值（650）/陰性對(duì)照平均值（NCx）。

2 結(jié)果與分析

2.1 S/N值測(cè)定結(jié)果 根據(jù)每個(gè)樣品的OD值測(cè)定結(jié)果，計(jì)算出每個(gè)樣品的S/N值，如表3、表4所示。由表3可以看出，從鳳陽(yáng)縣養(yǎng)殖場(chǎng)采集的91份羊血清中共有3份為甲型流感陽(yáng)性，陽(yáng)性樣品分別為G41、G43、G47。由表4可以看出，從銅陵、蚌埠和鳳陽(yáng)3地養(yǎng)殖場(chǎng)采集的91份豬血清中共有21份為甲型流感陽(yáng)性：養(yǎng)殖場(chǎng)1中S14、S17、S18、S20、S24、S26、S31、S32共8份樣品；養(yǎng)殖場(chǎng)2中S56、S67、S72、S73、S77共5份樣品；養(yǎng)殖場(chǎng)3中S78、S80、S81、S83、S84、S85、S86、S91共8份樣品。

2.2 甲型流感陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果與分析 由以上樣品的S/N值可以得出不同采樣地區(qū)豬和羊血清中甲型流感的陽(yáng)性率，如表5、表6所示。由表5可以看出，在采集到的91份羊血清樣品中，有3份顯示出陽(yáng)性，其陽(yáng)性率為3.3%。由表6可以看出，在從3地養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的共91份豬血清樣品中，有21份顯示出陽(yáng)性，其陽(yáng)性率為23.1%。

3 討論與小結(jié)

3.1 討論 目前，甲型流感主要在豬和禽類中間流行，而對(duì)于羊的感染率相對(duì)較低，因此對(duì)其研究較少。本研究利用ELISA方法對(duì)91份羊血清和91份豬血清的流感病毒的抗體檢測(cè)，檢測(cè)出91份羊血清樣品中甲型流感的陽(yáng)性率為3.3%，91份豬血清樣品中甲型流感的陽(yáng)性率為23.1%。文獻(xiàn)記載，李凱航等利用HI和HA的方法曾于2010年5月檢測(cè)從上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)所采集到的30份豬血清的H1N1亞型的抗體水平，測(cè)定的陽(yáng)性率為30%；而孫忠晟[9]也運(yùn)用此法對(duì)廣東地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)提供的豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為21.7%。

實(shí)際試驗(yàn)當(dāng)中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法對(duì)于流感病毒的檢測(cè)比更為簡(jiǎn)單、靈敏和準(zhǔn)確。該方法主要采用的是抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，進(jìn)行定量測(cè)定。在試驗(yàn)過程中，以下要點(diǎn)需要引起重視。首先，所采集到的血液樣品一定要保證新鮮，而且操作也要在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。這是因?yàn)?，菌體里面可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)的出現(xiàn)；其次，一般來(lái)說，5d以內(nèi)采集到的樣品在4℃下保存，超過一周的需進(jìn)行低溫保存。由于反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，對(duì)于低溫保存的凍結(jié)血清，取出后應(yīng)輕緩地充分混勻，切不可在混勻器上進(jìn)行強(qiáng)烈震蕩；再次，試劑的準(zhǔn)備要嚴(yán)格按照試劑盒說明書所要求配置，比如需要用到的蒸餾水或者去離子水，用于洗滌，應(yīng)是新鮮的和高質(zhì)量的，加樣的時(shí)候也要注意使用微量加樣器按照規(guī)定的兩加入對(duì)應(yīng)的板孔中，每次加樣都需更換槍頭，避免交叉污染；最后，在保溫的過程中，加入板孔中的樣品里不是所有的抗原都能和固相抗體結(jié)合。只有在最貼近孔壁出的才可以。這是一個(gè)逐步平衡的過程，需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。

據(jù)相關(guān)報(bào)道，甲型流感的暴發(fā)與流行對(duì)養(yǎng)殖業(yè)會(huì)造成一定的危害，因而養(yǎng)殖生產(chǎn)者應(yīng)高度重視對(duì)豬和羊（尤其是豬）流感的防控[10]。對(duì)于甲型流感所應(yīng)采取的措施有如下。第一，加強(qiáng)源頭控制，堅(jiān)決切斷污染源頭，做好養(yǎng)殖場(chǎng)壞境的消毒、糞便清理等工作，如疫病已發(fā)生，及時(shí)上報(bào)有關(guān)部門，進(jìn)行疫區(qū)封鎖，在疫區(qū)接觸封鎖前或疫病發(fā)生后對(duì)可能殘留的病原體進(jìn)行全面徹底地消毒，第二，加強(qiáng)過程控制和末端控制，對(duì)于可能產(chǎn)生或傳播甲型流感病毒的污染物，要求進(jìn)行無(wú)害化處理；第三，針對(duì)當(dāng)前我國(guó)豬流感病毒日趨復(fù)雜，亟需建立長(zhǎng)期有效的監(jiān)測(cè)體系，以掌握豬流感病毒的流行情況，從而實(shí)施科學(xué)防控。這樣不僅減少對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的直接經(jīng)濟(jì)損失，也可以降低出現(xiàn)新流感毒株的風(fēng)險(xiǎn)，具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[11]。

3.2 小結(jié) 本研究用ELISA方法檢測(cè)羊血清中甲型流感的陽(yáng)性率為3.3%，豬血清中甲型流感的陽(yáng)性率為23.1%，表明甲型流感在安徽地區(qū)有一定流行，應(yīng)采取防重于治的原則。

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（責(zé)編：張宏民）