劉彩麗，李嵐，王穎瑛，史雨玉

(安陽市婦幼保健院檢驗(yàn)科，河南 安陽 455000)

慢性乙型肝炎是世界上最常見的傳染病之一，乙肝病毒的傳染性比引起艾滋病的HIV病毒強(qiáng)100倍。中國是乙型肝炎的高發(fā)地區(qū)，乙肝病毒的持續(xù)感染造成乙肝慢性化，繼發(fā)肝硬化，肝細(xì)胞癌。乙肝母嬰垂直傳播是重要的傳播方式之一，在未給予干預(yù)的情況下，HBV母嬰垂直傳播比例高達(dá)90%，包括宮內(nèi)傳播、產(chǎn)時(shí)傳播以及產(chǎn)后傳播。宮內(nèi)傳播與胎盤屏障受損或者通透性增強(qiáng)引起母血滲漏有關(guān)。產(chǎn)時(shí)傳播是母嬰傳播的主要途徑，在分娩過程中子宮收縮使胎盤絨毛破裂，母血進(jìn)入胎兒循環(huán)，或者在胎兒經(jīng)過產(chǎn)道時(shí)，吞咽含有HB-sAg的母血、羊水、陰道分泌物，導(dǎo)致感染。分娩過程中的感染以及產(chǎn)后傳播機(jī)制明確，可通過縮短分娩時(shí)間，人工喂養(yǎng)等方式干預(yù)，預(yù)防傳播。目前宮內(nèi)傳播機(jī)制仍然是研究的熱點(diǎn)，也是有效阻斷垂直傳播的關(guān)鍵。國內(nèi)的研究顯示，HBsAg高滴度，HBeAg陽性，HBV DNA高滴度，先兆早產(chǎn)是宮內(nèi)傳播的危險(xiǎn)因素[1，2]。本文探討宮內(nèi)垂直傳播與胎兒HBeAg的關(guān)系及胎盤CD35表達(dá)水平，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月-2017年6月HBsAg陽性的孕婦121例為研究對象，根據(jù)新生兒臍血HBeAg結(jié)果分為HBeAg陽性組（58例）以及HBeAg陰性組（63例），另選擇HBsAg陰性孕婦分娩50例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：單胎，足月產(chǎn)，孕婦血清其他類型肝炎以及TTV均為陰性；無先兆早產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、妊娠期高血壓、其他感染性疾病病史；肝腎功能無異常；孕期未接受免疫調(diào)節(jié)劑、抗病毒藥物、細(xì)胞毒性藥物、激素類藥物治療；未合并免疫系統(tǒng)疾??；胎兒發(fā)育正常。孕婦丈夫非HBV攜帶；孕婦年齡、孕次、產(chǎn)次、胎齡、分娩方式等一般資料匹配（P＞0.05）。見表1。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2 材料、儀器以及試劑 HBV血清學(xué)標(biāo)志物ELISA試劑盒（上海雙贏生物科技有限公司）；人細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-6 ELISA試劑盒（北京同立海源生物科技有限公司）；HBV PCR熒光定量檢測試劑盒 （安徽達(dá)健醫(yī)學(xué)科技有限公司）。酶標(biāo)儀，PCR擴(kuò)增儀，37℃恒溫箱，Ependorff管，洗板機(jī)，微量加樣槍。1%鹽酸酒精溶液，各濃度酒精，二甲苯，石蠟，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠，鼠抗人CD35（北京愛博生生物技術(shù)有限公司），自配EDTA，DAB染色試劑盒，PBS液。切片機(jī)，恒溫箱，包埋紙盒，顯微鏡。

表1 三組一般資料比較

1.3 檢測項(xiàng)目及方法

1.3.1 標(biāo)本采集以及檢測項(xiàng)目 產(chǎn)前采集孕婦靜脈血 4ml，4℃保存，6h 后離心，3000rpm，10min， 取上清，進(jìn)行HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測以及HBV DNA檢測。分娩時(shí)，無菌條件下采集新生兒臍靜脈血5ml。2ml用于檢測血清HBV標(biāo)志物以及HBV DNA。定量檢測，余離心后取血清，分裝于EP管中，-70℃保存， 檢測 IL-2、IL-4、IL-6 以及 IFN-γ水平。胎盤娩出后，檢查無肉眼病理改變，生理鹽水清洗，分為4個(gè)象限，每個(gè)象限取1×1×2.0cm3大小中央帶全層，多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，待測胎盤CD35表達(dá)水平。

1.3.2 檢測方法 ⑴采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清HBV標(biāo)記物。⑵采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測HBV DNA。⑶采用ELISA方法測定細(xì)胞因子IL-2、4、6以及IFN-γ。所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。⑷胎盤CD35表達(dá)檢測：石蠟切片脫蠟，放入3%雙氧水-甲醛液中浸泡，消除內(nèi)源性過氧化酶，PBS沖洗3次，每次2min，抗原修復(fù)，吸干液體后，每張切片加10%山羊血清適量，覆蓋組織，孵育10min，吸干液體，用PBS液1：50比例稀釋鼠抗人CD35，每張切片加適量一抗，覆蓋至，4℃過夜。PBS液沖洗3次，每次2min，吸干液體，加抗小鼠生物素化二抗，覆蓋組織，孵育10min，PBS沖洗3次，每次2min，吸干液體，加HRP標(biāo)記的鏈親和素，覆蓋組織，孵育10min，PBS沖洗3次，每次2min；加DAB顯色液，室溫下2-15min顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染1min；梯度酒精脫水，二甲苯透明化處理，封片，鏡檢。陽性：CD35表達(dá)在紅細(xì)胞、白細(xì)胞細(xì)胞膜，少量在細(xì)胞漿，棕黃色。

1.4 分析方法 統(tǒng)計(jì)121例新生兒發(fā)生宮內(nèi)垂直感染的例數(shù)。胎兒宮內(nèi)垂直感染判斷：臍血HBsAg陽性或者HBV DNA陽性，未接種乙肝疫苗前股靜脈血HBsAg陽性或HBV DNA陽性。分析孕婦HBeAg陽性、新生兒臍血HBeAg陽性、孕婦HBV DNA陽性者宮內(nèi)感染率。比較三組臍血細(xì)胞因子水平。分析孕婦HBeAg與新生兒HBeAg陽性的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 F 檢驗(yàn)或 t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒宮內(nèi)垂直傳播發(fā)生率 121例新生兒，16例發(fā)生宮內(nèi)垂直傳播，感染率13.2%。發(fā)生宮內(nèi)垂直傳播新生兒HBsAg均為陽性，HBeAg陽性14例，占87.5%；新生兒HBV DNA陽性4例，占25.0%。孕婦HBeAg陽性、新生兒HBeAg陽性以及孕婦HBV DNA陽性宮內(nèi)感染率見表2。孕婦HBeAg陽性宮內(nèi)感染率顯著高于陰性，新生兒HBeAg陽性者宮內(nèi)感染率顯著高于陰性者，孕婦HBV DNA陽性者宮內(nèi)感染率顯著高于陰性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 孕婦HBeAg陽性、新生兒HBeAg陽性以及孕婦HBV DNA陽性宮內(nèi)感染率

2.2三組臍血細(xì)胞因子水平比較 見表3。HBeAg陽性組新生兒臍血IL-2、INF-γ水平顯著下降，IL-4及IL-6顯著升高，與HBeAg陰性組及對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HBeAg陰性組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 三組臍血細(xì)胞因子水平比較（pg/ml）

2.3 孕婦HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性的關(guān)系 見表4。孕婦65例HBeAg陽性，其中55例新生兒HBeAg陽性，相關(guān)性分析顯示兩者有顯著正相關(guān)的關(guān)系（r=0.791）。

表4 孕婦HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性的關(guān)系

2.4 胎盤組織CD35表達(dá)結(jié)果 共選擇HBsAg陽性的孕婦10例的胎盤檢測胎盤CD35，結(jié)果顯示，CD35主要表達(dá)在絨毛膜毛細(xì)血管的紅細(xì)胞膜，部分有核細(xì)胞有表達(dá)，而人胎盤滋養(yǎng)層、間質(zhì)細(xì)胞中無CD35表達(dá)。提示CD35在血細(xì)胞上表達(dá)，而人胎盤各層組織中不表達(dá)。

3 討論

既往對于HBV宮內(nèi)垂直傳播主要的研究是HBV通過胎盤途徑感染，孕婦血中病毒通過感染胎盤組織，從胎盤逐層最終傳遞給胎兒[3]。胎盤對胎兒有保護(hù)作用，在胎盤血管未發(fā)生破裂的情況下，病毒需要逐層感染胎盤的各層結(jié)構(gòu)才能最終達(dá)到胎兒。大量的研究證實(shí)胎盤不同細(xì)胞病毒感染率自母體面至胎兒面呈逐漸下降的趨勢，但宮內(nèi)傳播危險(xiǎn)性卻逐漸升高，并且胎盤各層感染率、宮內(nèi)感染率隨著妊娠周數(shù)增加而增加[4]。胎盤組織中 可 檢 測 到 HBsAg，HBeAg、HBV DNA 以 及HBcAg等標(biāo)志物，證實(shí)HBV可感染胎盤并在滋養(yǎng)層細(xì)胞中復(fù)制，發(fā)生病理改變，最終導(dǎo)致胎兒感染[5]。HBV進(jìn)入細(xì)胞后，HBsAg刺激細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)抗體，HBsAb的Fc片段可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物，如果胎盤組織有相應(yīng)受體表達(dá)，則可結(jié)合復(fù)合物，使HBV逐層傳遞[6]。CD35是補(bǔ)體C3受體。HBV在胎盤上以HBsAg-抗HBs-補(bǔ)體C3形式存在。補(bǔ)體C3受體CD35是單鏈膜結(jié)合蛋白。在本次研究中，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞并不固有表達(dá)CD35，說明HBV在胎盤進(jìn)行傳播時(shí)，可能并不通過HBsAg抗原-抗體-補(bǔ)體-補(bǔ)體受體途徑。

機(jī)體接觸病毒后是否感染以及感染后病情發(fā)展與免疫狀況密切相關(guān)，Th細(xì)胞是免疫應(yīng)答的中心樞紐，Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞維持機(jī)體細(xì)胞免疫以及體液免疫的功能[7]。如果Th1或Th2細(xì)胞某一個(gè)亞群功能升高，一個(gè)受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡的破壞。IL-2、INF-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；IL-4及IL-6主要由Th2細(xì)胞分泌，誘導(dǎo)體液免疫。正常情況下機(jī)體Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體正常的免疫反應(yīng)。而機(jī)體Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡是有效清除病毒以及病毒感染細(xì)胞的主要因素[8]。IL-2可刺激T細(xì)胞生長，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化，抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞等功能，抵御HBV感染。INF-γ可增強(qiáng)細(xì)胞免疫，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、活化NK細(xì)胞功能，可以在那轉(zhuǎn)錄后水平抑制HBV。IL-4調(diào)節(jié)體液免疫，對B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)作用，抑制Th1細(xì)胞因子表達(dá)。IL-6可誘導(dǎo)急性期蛋白合成，促進(jìn)干細(xì)胞壞死，促進(jìn)HBV感染，與肝癌、慢性肝炎的發(fā)生有關(guān)。在本次研究中，HBeAg陽性的新生兒IL-2、INF-γ水平下降，IL-4及IL-6水平升高，提示HBeAg可能抑制了胎兒Th1細(xì)胞分泌，促進(jìn)了Th2細(xì)胞的分泌，機(jī)體細(xì)胞免疫受到抑制，促進(jìn)HBV的感染[9]。分析結(jié)果也顯示HBeAg陽性的新生兒宮內(nèi)垂直感染率高于陰性的新生兒。

HBeAg是HBV傳染性強(qiáng)弱的標(biāo)志，既往的研究證實(shí)HBV DNA陽性，母體HBeAg陽性、新生兒HBeAg陽性是宮內(nèi)垂直感染的高危因素[10-13]。本次的研究結(jié)果顯示，母體HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性具有正相關(guān)的關(guān)系，母體HBeAg陽性增加了新生兒HBeAg陽性率。HBeAg有結(jié)合與游離兩種形式，而結(jié)合狀態(tài)的HBeAg能自由通過胎盤，到達(dá)胎兒血液循環(huán)，這與胎盤組織上過表達(dá)HBeAg-抗HBe-補(bǔ)體復(fù)合物受體有關(guān)，在其作用下介導(dǎo)HBeAg通過胎盤，進(jìn)入胎兒血液循環(huán)[14，15]。在本次研究中也證實(shí)這母體HBeAg陽性者，新生兒HBeAg陽性率也更高，并且母體HBeAg陽性者宮內(nèi)垂直感染率更高。孕婦HBV DNA陽性者新生兒宮內(nèi)垂直感染率也顯著高于陰性，與既往研究結(jié)果相似。有3例孕婦HBeAg陰性者而新生兒HBeAg陽性，可能與宮內(nèi)感染后，新生兒自身產(chǎn)生相應(yīng)抗原。

綜上所述，孕婦HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性顯著正相關(guān)的關(guān)系；新生兒HBeAg陽性者宮內(nèi)感染率更高；HBV宮內(nèi)垂直傳播的新生兒存在機(jī)體免疫失衡；人胎盤滋養(yǎng)層、間質(zhì)細(xì)胞中無CD35表達(dá)，提示HBV在胎盤進(jìn)行傳播時(shí)，可能并不通過HBsAg抗原-抗體-補(bǔ)體-補(bǔ)體受體途徑。

[1]李祥，胡超，王太武，等.HBV宮內(nèi)感染危險(xiǎn)因素的病例對照研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46（16）：2187-2192.

[2]王蘭芳，蔡娟，何劉媛，等.乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦感染狀態(tài)與新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染的相關(guān)性分析 [J].中華疾病控制雜志，2014，18(5)：391-393.

[3]劉昳，宗時(shí)春，葉峰，等.胚胎中HBVmRNA與母嬰垂直傳播關(guān)系的研究[J].中國婦幼健康研究，2013，24(4)：492-494.

[4]劉志國，思希堯，李嬌，等.河北地區(qū)新生兒臍血T細(xì)胞亞群與HBV 宮內(nèi)感染相關(guān)性研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46（1）：29-32.

[5]劉敏，鐘清華，鐘水嬌.乙肝攜帶孕婦與新生兒乙肝標(biāo)志物的表達(dá)形式及其胎兒宮內(nèi)染感率分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，30(5)：515-517.

[6]謝春梅，張瓊芳，張大志.HBV宮內(nèi)感染發(fā)生機(jī)制及阻斷方案進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2016，32（10）：1514-1517.

[7]栗軍香，沈香榮，鄭麗娟，等.白細(xì)胞介素-10、17、21的表達(dá)與HBV宮內(nèi)感染的相關(guān)性研究 [J].中國臨床醫(yī)生，2016，44（10）：92-95.

[8]栗軍香，王銀茹，李阿靜，等.Treg/TH17細(xì)胞因子的平衡作用與不同中醫(yī)癥候HBV宮內(nèi)感染相關(guān)性研究[J].海南醫(yī)學(xué)，2016，27（21）：3448-3451.

[9]中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)產(chǎn)科學(xué)組.乙型肝炎病毒母嬰傳播預(yù)防臨床指南（第 1版）[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，48(5)：321-325.

[10]趙登賢，楊文東.HBV-DNA陽性孕婦產(chǎn)后臍帶血及乳汁中HBV-DNA載量的檢測分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013，31(1)：64-66.

[11]黃晨艷，劉輝，董娟，等.圍產(chǎn)期母血與臍血乙肝標(biāo)志物及DNA載量關(guān)聯(lián)性研究 [J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2012，26(5)：324-327.

[12]楊紅梅.乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦感染狀態(tài)與新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染的相關(guān)性[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，38（5）：503-505.

[13]郭珍，魏俊妮，馮麗萍，等.HBsAg陽性孕婦新生兒HBV宮內(nèi)感染的影響因素研究[J].衛(wèi)生研究，2011，40(2)：180-183.

[14]王蘭芳，蔡娟，何劉媛，等.乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦感染狀態(tài)與新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染的相關(guān)性分析[J].中華疾病控制雜志，2014，18(5)：391-393.

[15]王敏芝.乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦感染狀態(tài)與新生兒母嬰傳播的相關(guān)性研究[J].中國婦幼保健，2017，32(11)：2360-2363.