卜克，王璐，王偉，張晶芳，劉林剛

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

膿毒癥作為各種因素導(dǎo)致的全身性炎性反應(yīng)綜合癥，可累及多個(gè)系統(tǒng)和器官，是導(dǎo)致患者死亡的重要因素[1]，其中膿毒癥患者繼發(fā)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)40%～70%[2]，死亡率更是超過了70%[3]，嚴(yán)重威脅患者生命安全。有研究指出，若能早期發(fā)現(xiàn)并采取有效措施阻止膿毒癥繼發(fā)AKI患者腎功能不可逆性損傷，可減少患者死亡。硫化氫（hy-drogen sulfide，H2S）作為一種新型氣體信號(hào)分子，具有多種生物學(xué)活性，與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)[4]，可通過抗炎、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而減少機(jī)體損傷[5]，有研究指出[6]，H2S可通過抑制氧化應(yīng)激減輕腎臟缺血再灌注損傷。本研究擬探討外源性補(bǔ)充H2S對膿毒癥大鼠AKI保護(hù)作用，并探討可能的機(jī)制，以期為臨床早期干預(yù)膿毒癥繼發(fā)AKI提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與試劑 凝膠電泳影像分析系統(tǒng)（美國 Bio－rad）；脂多糖（LPS，規(guī)格 10mg）和 NaHS（美國 Sigma 公司）；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）檢測試劑盒（美國R&D公司）；HE染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；TUNEL試劑盒 （美國Roche公司）；兔抗鼠Caspase－3多克隆抗體（美國CST公司）；兔抗大鼠 Bcl－2、Bax單克隆抗體 （美國 Santa Cruz公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠40只購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 （合格證號(hào)：SCXK（豫）2010－0002），6～8 周齡，體重（200±20）g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食、飲水。所有動(dòng)物編號(hào)后，利用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組和H2S干預(yù)組，每組10只。

1.3 大鼠膿毒癥急性腎損傷模型制備及分組處理參照文獻(xiàn)[7]中介紹的盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥急性腎損傷模型。取各組大鼠，禁飲禁食10h，利用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰臥位固定，備皮消毒，取腹中線切口開腹，將腸系膜和盲腸充分游離后，用4號(hào)無菌絲線在回盲瓣以下進(jìn)行環(huán)形結(jié)扎，使用20號(hào)針頭在盲端部進(jìn)行貫通穿孔，擠出少量糞便后，放回腹腔，關(guān)腹，逐層縫合。以術(shù)后30min時(shí)出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、毛發(fā)失去光澤、呼吸急促、喜飲水、解稀便作為模型成功標(biāo)志。假手術(shù)組麻醉后開腹翻動(dòng)腸道后即關(guān)腹。H2S干預(yù)組于造模后30min按10mg/kg劑量腹腔注射NaHS，生理鹽水組按同樣的方法給予等量生理鹽水。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠未出現(xiàn)死亡。

1.4 各組大鼠血清中Scr和BUN水平檢測 各組大鼠于造模12h后，采集各組大鼠股動(dòng)脈血，3000r/min離心15min分離血清，利用全自動(dòng)生化儀對血清中Scr和BUN水平進(jìn)行檢測。

1.5 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察 各組大鼠于造模12h后，處死，將雙側(cè)腎臟摘除，將右腎快速保存于－70℃液氮中，取部分左腎組織，4%多聚甲醛固定后，梯度酒精脫水，石蠟包埋后，切片，HE染色，利用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6 各組大鼠血清和腎臟組織中 MDA、SOD、IL－1β、TNF－α水平檢測 采集各組大鼠股動(dòng)脈血，3000r/min離心15min分離血清，取部分右腎組織，用預(yù)冷生理鹽水制備組織勻漿，4℃下于3500r/min離心20min，留取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法分別檢測血清和腎臟組織中MDA、SOD、IL－1β、TNF－α 水平，所有操作均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，按試劑盒說明完成操作。

1.7 TUNEL法檢測各組大鼠腎臟組織中細(xì)胞凋亡取各組大鼠腎臟組織石蠟標(biāo)本，切片后，脫蠟水化，利用檸檬酸鈉緩沖液微波120s進(jìn)行抗原修復(fù)，3%雙氧水處理4min，用PBS清洗 3次，加入TUNEL試劑，于37℃下孵育90min，加入3%甲醛－H2O2溶液阻斷 15min，加入 POD 轉(zhuǎn)換液 50μl，37℃孵育25min，用PBS清洗3次，DAB顯色6min，蘇木素復(fù)染，制片后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照，隨機(jī)取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.8 Western blot法檢測各組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bcl－2、Bax 蛋白表達(dá) 取部分右腎組織，剪碎后研磨，加入細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白，用BCA總蛋白檢測試劑盒檢測蛋白純度并定量。取30μg總蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉120min，分別將一抗兔抗鼠Caspase－3多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl－2、Bax 單克隆抗體加入（稀釋比例：1：1200、1：800、1：1000），4℃下過夜孵育，用 TBST 沖洗 3 次，加入二抗，室溫下孵育120min，用TBST沖洗3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑避光反應(yīng)20min，拍照，利用Image J圖像分析軟件對各組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bcl－2、Bax 蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成數(shù)據(jù)整理分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD－t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中Scr和BUN水平 與假手術(shù)組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預(yù)組大鼠血清中Scr和BUN水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組和生理鹽水組相比，H2S 干預(yù)組大鼠血清中Scr和BUN水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 1。

表1 各組大鼠血清中Scr和BUN水平比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠血清中Scr和BUN水平比較（n=10，±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與生理鹽水組相比，cP＜0.05。

BUN（mmol/L）5.97±0.37 30.15±4.28a 29.13±4.17a 17.29±4.98abc 74.086 0.000組別假手術(shù)組模型組生理鹽水組H2S干預(yù)組F P Scr（μmol/L）39.54±5.83 128.65±12.37a 131.28±13.16a 78.32±9.14abc 172.066 0.000

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎臟組織中細(xì)胞排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整，胞核居中、核仁清楚，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，未發(fā)生變性、壞死，腎小球形態(tài)未發(fā)生改變；模型組和生理鹽水組大鼠腎臟組織中腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、水樣變性、空泡變性，腎小管出現(xiàn)擴(kuò)張、其間可見脫落細(xì)胞，腎間質(zhì)出現(xiàn)充血水腫，出現(xiàn)腎小球炎表現(xiàn)；與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預(yù)組大鼠腎臟組織損傷減輕，細(xì)胞異常減少，間質(zhì)充血水腫減輕，詳見圖1。

2.3 各組大鼠血清和腎臟組織中 MDA、SOD、IL－1β、TNF－α水平 與假手術(shù)組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預(yù)組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均升高，而SOD水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預(yù)組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均降低，而SOD水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 2。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化（A：假手術(shù)組；B：模型組；C：生理鹽水組；D：H2S 干預(yù)組，HE×400）

2.4 各組大鼠腎臟組織中細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組大鼠腎臟組織中偶見凋亡的腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率（5.2±1.4）%，與假手術(shù)組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均升高，分別為（21.6±4.8）%、（22.8±5.6）%和（11.5±2.7）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.374，P=0.000），與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預(yù)組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腎臟組織中 Caspase－3、Bcl－2、Bax蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預(yù)組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bax蛋白相對表達(dá)量均升高，而Bcl－2蛋白相對表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預(yù)組大鼠腎臟組織中Caspase－3、Bax蛋白相對表達(dá)量均降低，而 Bcl－2 蛋白相對表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表3和圖2。

3 討論

膿毒癥作為重癥監(jiān)護(hù)室患者首要的致死性疾病，發(fā)病率較高且呈逐年上升趨勢[8]，嚴(yán)重威脅人類生命健康。目前，膿毒癥發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，且發(fā)病過程中可導(dǎo)致多器官損傷，其中，AKI是常見的并發(fā)癥，且病情危重，臨床治療效果不佳，具有較高的致死率[9]。H2S作為繼NO、CO后又一種新型氣體信號(hào)分子，已被發(fā)現(xiàn)在機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮重要生理調(diào)節(jié)作用[10]，在抗炎、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，對抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)重要器官具有重要意義[11]。張穎等[12]指出，H2S作為一種內(nèi)源性介質(zhì)可通過作用于線粒體調(diào)節(jié)能量代謝而減輕截止創(chuàng)傷導(dǎo)致的大鼠腎結(jié)構(gòu)和功能損害。許武軍等[13]等指出，內(nèi)源性H2S通過抑制NF－κB表達(dá)而減輕尿源性膿毒血癥腎損傷。本研究利用經(jīng)尾靜脈注射LPS的方法建立大鼠膿毒癥模型，HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟組織中腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、水樣變性、空泡變性，腎小管出現(xiàn)擴(kuò)張、其間可見脫落細(xì)胞，腎間質(zhì)出現(xiàn)充血水腫，出現(xiàn)腎小球炎表現(xiàn)，同時(shí)，模型組大鼠血清中Scr和BUN水平均升高，說明膿毒癥大鼠發(fā)生了AKI，模型構(gòu)建成功。

表2 各組大鼠血清和腎臟組織中MDA、SOD、IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血清和腎臟組織中MDA、SOD、IL-1β、TNF-α水平比較（n=10，±s）

組別 血清M D A（n m o l/L）假手術(shù)組模型組生理鹽水組H 2 S干預(yù)組F P 5.0 8±0.7 5 1 2.8 5±1.1 7 1 3.0 6±1.2 1 8.9 5±0.8 2 1 4 8.6 4 1 0.0 0 0腎臟組織3.7 2±0.8 1 7.3 2±0.9 9 7.2 7±0.8 5 5.9 1±0.9 6 2 5.0 1 8 0.0 0 0 S O D（U/m L）I L－1 β（n g/L）血清 腎臟組織 血清 腎臟組織 血清 腎臟組織1 6 6.7 2±1 2.0 7 1 0 9.6 5±1 1.8 6 1 1 1.3 4±1 2.0 5 1 3 2.8 6±1 1.4 3 5 0.3 4 4 0.0 0 0 T N F－α（n g/L）M D A（n m o l/L）8 4.1 7±1 3.9 8 4 0.3 8±1 1.6 4 3 9.2 7±1 0.5 9 6 0.2 6±9.6 2 4 4.2 9 0 0.0 0 0 4 8.2 4±5.6 8 1 0 8.3 5±1 0.5 7 1 1 2.5 2±1 2.8 6 7 3.2 8±8.9 7 1 0 5.7 8 3 0.0 0 0 7 8.9 5±1 0.2 8 3 6 8.2 5±1 6.1 7 3 5 9.9 2±1 3.9 4 1 0 2.3 6±9.5 3 1 8 6 1.3 8 6 0.0 0 0 6 7.2 8±4.0 9 9 5.1 5±5.3 7 9 8.2 6±5.7 2 8 0.3 1±4.4 2 6 6.3 5 2 0.0 0 0 1 0 8.3 6±6.1 7 1 5 2.2 7±7.9 8 1 5 7.1 6±8.1 8 1 2 9.3 5±6.5 2 6 9.1 6 2 0.0 0 0

表3 各組大鼠腎臟組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（n=10，±s）

表3 各組大鼠腎臟組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（n=10，±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與生理鹽水組相比，cP＜0.05。

0.2 6±0.0 8 0.6 2±0.1 0 a 0.6 0±0.0 7 a 0.4 3±0.1 4 abc 3 8.9 9 1 0.0 0 0組別假手術(shù)組模型組生理鹽水組H 2 S干預(yù)組F P C a s p a s e－3 蛋白0.3 4±0.1 1 0.8 0±0.1 6 a 0.7 8±0.1 3 a 0.5 1±0.1 2 abc 1 2.1 1 5 0.0 0 0 B c l－2 蛋白 B a x蛋白0.7 2±0.1 5 0.3 1±0.0 9 a 0.3 3±0.1 0 a 0.5 4±0.1 1 abc 4 9.7 2 1 0.0 0 0

圖2 各組大鼠腎臟組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

本結(jié)果顯示，與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預(yù)組大鼠血清中Scr和BUN水平均降低，HE染色結(jié)果顯示，H2S干預(yù)組大鼠腎臟組織損傷減輕，細(xì)胞異常減少，間質(zhì)充血水腫減輕，說明給予H2S干預(yù)后，可有效減輕膿毒癥AKI大鼠腎組織損傷。MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，是反映機(jī)體組織、細(xì)胞等受氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)志物，SOD作為一種保護(hù)性抗氧化酶，在清除自由基保護(hù)組織、器官中發(fā)揮重要作用[14]，IL－1β 和 TNF－α 作為單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，與機(jī)體炎癥反應(yīng)水平密切相關(guān)，是反映機(jī)體炎癥程度的指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預(yù)組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均升高，而SOD水平降低，說明膿毒癥AKI大鼠機(jī)體和腎臟組織中發(fā)生了氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，同時(shí)，結(jié)果顯示，與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預(yù)組大鼠血清和腎臟組織中MDA、IL－1β和TNF－α水平均降低，而SOD水平升高，說明在給予H2S干預(yù)后，膿毒癥AKI大鼠機(jī)體和腎臟組織中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)水平降低，提示H2S可能通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

本結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、生理鹽水組和H2S干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均升高，與模型組和生理鹽水組相比，H2S干預(yù)組細(xì)胞凋亡率降低，說明外源性給予H2S干預(yù)后，可有效減少膿毒癥AKI大鼠腎組織中上皮細(xì)胞凋亡。Bcl－2和Bax是Bcl－2家族重要成員，Bcl－2在抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，而Bax則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl－2/Bax平衡失調(diào)后，可導(dǎo)致一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而最終導(dǎo)致執(zhí)行細(xì)胞凋亡的Caspase－3分子激活，啟動(dòng)凋亡程序而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]，本研究顯示，膿毒癥AKI大鼠腎臟組織中抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，從而激活Caspase－3使細(xì)胞發(fā)生凋亡，而外源性給予H2S干預(yù)后，這一過程被逆轉(zhuǎn)，從而減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，H2S可有效改善膿毒癥AKI大鼠腎功能，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，抑制凋亡相關(guān)基因活化，從而減少腎臟組織中細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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