張松躍，任躍，何躍娥，李皓，吳蓉洲

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童心臟中心 溫州醫(yī)科大學(xué)心臟發(fā)育與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，浙江 溫州 325027）

高肺血流所致肺動脈高壓（pulmonary arterialhypertension，PAH）是未經(jīng)治療左向右分流型先天性心臟病患者的嚴(yán)重合并癥，最終會導(dǎo)致艾森門格綜合征，直接影響其手術(shù)時機(jī)、成功率及術(shù)后的長期生存質(zhì)量。既往研究表明，尾加壓素 II（urotensin II，U II）在PAH的形成中起重要作用，但UII在PAH中的具體作用機(jī)制目前尚不明確[1-3]。本研究采用外科手術(shù)建立分流術(shù)模型，以模擬左向右分流型先天性心臟病所致PAH，應(yīng)用U II受體拮抗劑帕洛舒侖（Palosuran）[4]，研究U II在PAH模型中的表達(dá)及其對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）表達(dá)的影響，以探討高肺血流性PAH的病理生理過程及可能存在的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑：帕洛舒侖、DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS（胎牛血清）均購自美國Hyclone公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG均購自美國Abcam公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、甘氨酸及Tris均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；β-tubulin抗體、Tween20均購自美國Sigma-Aldrich公司；蛋白marker購自美國Thermo公司；抗U II多克隆抗體購自武漢博士德生物公司；DEPC購自上海生工生物工程有限公司；Dream Taq TM Green PCR Master Mix購自美國Thermo Fisher公司；Redzol、引物合成試劑盒購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；U II標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺（蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司），高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司），蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），反轉(zhuǎn)錄儀（美國Thermo Fisher公司），PCR儀（美國Thermo Fisher公司），凝膠成像分析儀（法國Vilber Lourmat公司），熒光顯微鏡測定儀（德國萊卡公司），倒置相差顯微鏡（日本尼康公司），激光共聚焦掃描顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 高肺血流型PAH模型建立及分組：選取60只體質(zhì)量100～120 g的雄性SD大鼠[購自上海斯萊克公司，動物許可證號：SCXX（滬）2007-0005]。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組20只，分別為PAH組（S組）、假手術(shù)組（C組）及U II抑制組（M組）。S組和M組參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行造模：頸部正中切口，逐層分離，游離右側(cè)頸總動脈和頸外靜脈，4-0縫線結(jié)扎大鼠頸總動脈遠(yuǎn)心端，確認(rèn)后，再取血管鉗阻斷其近心端，于遠(yuǎn)心端結(jié)扎線以下0.5 cm處切斷頸總動脈，使頸總動脈固定于自制套管上，再將縫扎的動脈端插入頸外靜脈上，觀察發(fā)現(xiàn)靜脈充血，或見明顯靜脈搏動，表明血管通暢，造模成功。C組僅游離頸總動脈、頸外靜脈。M組大鼠造模后1周給予U II受體抑制劑帕洛舒侖灌胃，每次300 mg·kg-1，每日2次。其余組予等劑量0.9%氯化鈉溶液每日2次做對照。

1.2.2 右心室壓力測定：分別于造模后第4、第8、第12周，按隨機(jī)數(shù)字表法每組選取5只大鼠，采用45 mg·kg-1苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用右 心導(dǎo)管導(dǎo)引插管分別檢測右心室壓力（相當(dāng)于肺動脈壓力）[6]，12周頸椎脫臼法處死后再留取心臟及肺組織標(biāo)本。

1.2.3 Western blot法檢測肺組織中U II和TGF-β1蛋白的表達(dá)：凍存的肺組織細(xì)胞加5倍體積細(xì)胞裂解液后于超聲勻漿儀勻漿至無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，離心分裝，用SDS煮沸變性后上樣于聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，與非放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合成像以檢測相關(guān)抗原的質(zhì)與量，采用Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)來分析上述蛋白光密度值。

1.2.4 RT-PCR檢測肺組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)：取左下肺組織200 mg在液氮中研磨，一步法提取總RNA，后加入提前設(shè)計好的引物于PCR儀上進(jìn)行RT擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物mRNA再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與Marker比較檢測mRNA的含量，以β-tubulin為內(nèi)參照。引物設(shè)計：檢索Genbank數(shù)據(jù)庫中β-tubulin、TGF-β1的mRNA序列，利用primer 5.0軟件設(shè)計引物，然后經(jīng)過Blast匹對，由上海賽百盛基因技術(shù)工程有限公司合成。β-tubulin上游引物5’-TACAATGGCTCCTCCGAT CT-3’，下游引物5’-AGATCAACCAGGACGGCA-3’，產(chǎn)物長度96 bp；TGF-β1上游引物5’-CAAGCAGAACCCAGTCTAT GC-3’，下游引物5’-TGAGGGACTCTGGTCTTTGTG-3’，產(chǎn)物長度432 bp。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)，兩兩比較方差齊性者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’sT3檢驗(yàn)，U II及TGF-β1蛋白表達(dá)與肺動脈壓力值的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠生存情況及右心室壓力比較 S組術(shù)后死亡4只大鼠（死于右心衰竭），M組術(shù)后死亡3只大鼠（死于右心衰竭），C組術(shù)后死亡1只大鼠（死因不明），死亡時間多在術(shù)后2～3周。造模后第4、第8、第12周，S組大鼠右心室壓力均顯著高于C組，M組顯著低于S組，M組顯著高于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠右心室壓力值隨時間變化情況（n=5±s，mmHg）

表1 3組大鼠右心室壓力值隨時間變化情況（n=5±s，mmHg）

與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

組別 第4周 第8周 第12周C組 18.5±0.43 17.9±0.35 19.0±0.37 S組 25.3±1.53a 31.2±1.46a 37.4±1.32a M組 23.4±1.08ab 28.3±0.94ab 33.6±1.14ab

2.2 3組大鼠肺組織UI I和TGF-β1蛋白表達(dá)量比較 造模后第12周，S組大鼠肺組織中U II蛋白表達(dá)量較C組顯著升高，M組較S組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。S組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)量較C組顯著升高，M組較S組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 3組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)量比較 造模后第12周，S組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)量較C組顯著升高，M組較S組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 相關(guān)性分析 U II蛋白表達(dá)量與肺動脈壓力值、TGF-β1蛋白表達(dá)量及mRNA表達(dá)量均呈正相關(guān)（r=0.987、0.979、0.966，P＜0.05）。見圖4。

3 討論

圖1 3組大鼠U II蛋白表達(dá)量比較（n=5）

圖2 3組大鼠TGF-β1蛋白表達(dá)量比較（n=5）

高肺血流性PAH是左向右分流型先天性心臟病最常見的并發(fā)癥，對疾病發(fā)展和預(yù)后有決定作用。以往以PAH發(fā)生機(jī)制為中心，人們已經(jīng)對多種體液、神經(jīng)及局部因素于PAH的形成過程當(dāng)中重建肺血管架構(gòu)和舒縮功能效果進(jìn)行了研究，但PAH病理過程十分復(fù)雜，至今尚未徹底闡明其發(fā)病機(jī)制[7-9]。

圖3 3組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)量比較（n=5）

U II是目前發(fā)現(xiàn)收縮血管活性最強(qiáng)的活性肽[10]。我們的前期研究中也發(fā)現(xiàn)，在先天性心臟病PAH患兒的肺組織中存在著U II的表達(dá)，并隨著肺動脈壓力的升高表達(dá)明顯增強(qiáng)[3]。PAH是指肺動脈平均壓＞30 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）者，本研究中使用外科手術(shù)建立分流模型[5]，以模擬左向右分流型先天性心臟病所致PAH。大鼠于造模后監(jiān)測右心室壓力，至第12周，S組和M組大鼠右心室壓力均＞30 mmHg，提示PAH，表明模型建立成功。本研究發(fā)現(xiàn)相對于C組，S組中存在U II蛋白含量顯著升高，而在給予U II受體拮抗劑帕羅舒侖后，肺動脈壓力顯著降低，且經(jīng)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)U II蛋白表達(dá)與肺動脈壓力呈正相關(guān)關(guān)系，因而我們推測，U II在高肺血流性PAH大鼠模型中表達(dá)增高，可能參與了PAH的發(fā)生發(fā)展。

研究表明，肺血管重構(gòu)是PAH發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積是肺血管重構(gòu)的基礎(chǔ)[11-12]。而TGF-β是促進(jìn)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和膠原合成的重要活性因子。其中TGF-β1是目前研究較多的細(xì)胞因子，活性最強(qiáng)，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和ECM沉積。WANG等[13]報道，暴露在煙霧中的倉鼠發(fā)生PAH和肺血管重構(gòu)過程中，TGF-β1蛋白顯著升高。利用TGF-β1抑制劑SD-208可明顯降低野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH模型中肺動脈壓力和血管重構(gòu)程度[14]。DAI等[15]在體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1抗體能抑制U II的促膠原合成作用，且U II能夠促進(jìn)TGF-β1及其mRNA的表達(dá)，這表明U II可能通過TGF-β1發(fā)揮促心肌纖維化的作用。

圖4 大鼠肺組織中U II蛋白表達(dá)量與肺動脈壓力、TGF-β1蛋白表達(dá)量及mRNA表達(dá)量的相關(guān)性（n=10）

研究發(fā)現(xiàn)，PAH組大鼠肺組織中U II、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)水平相對于假手術(shù)組有顯著升高，相關(guān)性分析顯示U II與TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示在高肺血流性PAH大鼠模型中，存在TGF-β1表達(dá)，U II能夠促進(jìn)TGF-β1濃度增加，而在給予U II受體拮抗劑帕羅舒侖后，大鼠肺組織中U II、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著降低。推測其機(jī)制可能是帕羅舒侖抑制U II與其受體結(jié)合，使U II及TGF-β1表達(dá)水平降低，減輕血管收縮，抑制血管重構(gòu)，從而緩解PAH的產(chǎn)生。

綜上所述，在PAH大鼠模型中存在U II高表達(dá)，給予U II受體拮抗劑帕羅舒侖可顯著抑制U II的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過減少TGF-β1表達(dá)，而緩解大鼠高血 流性PAH形成和血管重建，但有待進(jìn)一步研究闡明。

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