査文勇 陸曉燕 趙雙雙

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，上海200240）

0 引言

維生素B12，又稱為鈷胺素，是唯一含有金屬元素的維生素。自然界中的維生素B12都是微生物合成的，高等植物和動(dòng)物不能制造維生素B12。同時(shí)，維生素B12是唯一一種需要腸道分泌物（內(nèi)源性因子）幫助才能被吸收的維生素。有些人由于腸胃異常，缺乏這種內(nèi)源性因子，即使有足夠的食物來(lái)源，他們?nèi)詴?huì)患上惡性貧血。在目前已知的植物性食品中基本上都不含有維生素B12，且其停留在腸道的時(shí)間很長(zhǎng)，大約需要3h（大部分水溶性維生素只需幾秒鐘）才能被吸收。

維生素B12的主要生理功能是參與制造骨髓紅細(xì)胞，預(yù)防惡性貧血以及腦損傷。維生素B12是淺紅色針狀結(jié)晶，易溶于水和乙醇，但是不溶于丙酮、乙醚或氯仿。其在pH值為4.5～5.0的弱酸條件下最穩(wěn)定，在強(qiáng)酸（pH=2）或堿性溶液中會(huì)分解，遇熱會(huì)少量受損，但短時(shí)間的高溫消毒損失小，遇強(qiáng)光或紫外線易被破壞，普通蒸煮過(guò)程的損失量約為30%。

本文主要考察影響注射用水溶性維生素中B12含量的因素，通過(guò)比較兩種不同的配制方法，擇優(yōu)選取其中一種，使得產(chǎn)品的合格率得到顯著提升。

1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 處方組成

注射用水溶性維生素的處方組成如表1所示。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀（批號(hào)20170109），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（批號(hào)17070452），TEDIA公司；10%鹽酸溶液（批號(hào)170922）、磷酸二氫鉀（批號(hào)T20100804），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀（批號(hào)F20100813），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸（批號(hào)20170109），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 對(duì)照品

煙酰胺（含量99.9%），批號(hào)100115-201604；硝酸硫胺（含量99.8%），批號(hào)100297-201402；鹽酸吡哆辛（含量100.0%），批號(hào)100116-201404；泛酸鈉（含量99.9%），批號(hào)100279-201203；維生素C鈉（含量99.9%），批號(hào)100296-201104；維生素B12（含量90.2%），批號(hào)100248-201203。

1.2 儀器和設(shè)備

不銹鋼鋼桶、攪拌棒、不銹鋼鋼勺、玻璃棒、燒杯、不銹鋼杯子、剪刀、不銹鋼棒；Agilent1200型高效液相色譜儀，安捷倫公司；ME104型天平、AB135-S型天平，梅特勒公司。

表1 處方組成

2 方法和結(jié)果

2.1 配制方法和測(cè)定方法

2.1.1 配制方法

2.1.1.1 方法1配制過(guò)程

（1）準(zhǔn)確稱取配制總量80%的注射用水（水溫控制在65～70℃）置于160L不銹鋼桶中，通氮?dú)猓ㄓ袣怏w冒出即可）5min后，分別取其中的1L注射用水置于兩只塑料勺中（水溫控制在60～65℃），將配制量的維生素B12（注意避光）加入至塑料勺中，用玻璃棒不斷攪拌5min后沉淀約5min，視其全部溶解，將配制量的生物素加入至另一塑料勺中，用玻璃棒攪拌使其全部溶解，混合后即得溶液1。

（2）將配制量的甘氨酸、尼泊金甲酯、依地酸二鈉、核黃素磷酸鈉（注意避光）、煙酰胺、葉酸、硝酸硫胺、鹽酸吡哆辛、右旋泛酸鈉，按順序逐一投入至上述160L的不銹鋼桶中，每投一種原輔料后均需充分?jǐn)嚢杈鶆?，使其全部溶解，然后再投入下一個(gè)原輔料，溶液攪拌均勻后，即得溶液2。

（3）仔細(xì)觀察溶液1藥液澄清后，將其并入溶液2中，并用不銹鋼棒攪拌均勻后得到溶液3。

（4）準(zhǔn)確稱取配制總量20%的注射用水（水溫控制在30～40℃）置于40L不銹鋼桶中，通氮?dú)猓ㄓ袣怏w冒出即可）5min，將配制量的維生素C鈉投入其中，并用不銹鋼棒攪拌均勻，使其溶解，然后并入溶液3（水溫控制在30～40℃）中，通氮?dú)猓ㄓ袣怏w冒出即可）5min，并攪拌均勻。

（5）QA人員取樣后，送給質(zhì)量檢驗(yàn)員進(jìn)行中間體（藥液）的分析，測(cè)pH值。

2.1.1.2 方法2配制過(guò)程

（1）準(zhǔn)確稱取配制總量80%的注射用水（水溫控制在60～70℃）置于配液罐中，通氮?dú)猓ㄓ袣怏w冒出即可）5min后，取其中的1L注射用水置于玻璃燒杯中，將處方量的生物素加入至玻璃燒杯中，用玻璃棒攪拌使其全部溶解，即得溶液1。

（2）在配液罐中加入處方量的甘氨酸，攪拌使其完全溶解，再依次加入處方量的對(duì)羥基苯甲酸甲酯、依地酸二鈉、核黃素磷酸鈉（注意避光）、煙酰胺、葉酸、硝酸硫胺、鹽酸吡哆辛、泛酸鈉，按順序逐一投入至上述配液罐中，每投一種原輔料后均需充分?jǐn)嚢杈鶆?，使其全部溶解，然后再投入下一個(gè)原輔料，溶液攪拌均勻后，即得溶液2。

（3）仔細(xì)觀察溶液1藥液澄清后，將其并入溶液2中，攪拌并降溫至20～30℃。

（4）準(zhǔn)確稱取配制總量20%的注射用水（水溫控制在20～30℃）置于不銹鋼桶中，通氮?dú)猓ㄓ袣怏w冒出即可）5min后，取其中的1L注射用水置于玻璃燒杯中，將處方量的維生素B12（注意避光）加入至玻璃燒杯中，用玻璃棒攪拌使其全部溶解，并繼續(xù)攪拌10min，即得溶液3。

（5）將處方量的維生素C鈉投入至上述不銹鋼桶中，并攪拌均勻，使其溶解，然后將該溶液并入配液罐。

（6）仔細(xì)觀察溶液3藥液澄清后，將其并入配液罐中，并用不銹鋼棒攪拌均勻后，通氮?dú)猓ㄓ袣怏w冒出即可）5min，攪拌均勻（約10min），測(cè)定其pH值應(yīng)在5.8～6.1。

2.1.2 維生素B12測(cè)定

2.1.2.1 色譜條件

維生素B12測(cè)定方法的色譜條件如表2所示，梯度比例如表3所示。

2.1.2.2 溶液配制

（1）對(duì)照品溶液：取維生素B12對(duì)照品約25mg，精密稱定，置于250mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻；精密量取1mL，置于100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）供試品溶液：取本品5瓶，用適量水溶解后轉(zhuǎn)移至同一25mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制兩份供試品溶液。

2.1.3 測(cè)定法

2.1.3.1 空白試驗(yàn)

取冷卻至常溫的注射水，至少進(jìn)樣1針，確認(rèn)其對(duì)測(cè)試無(wú)干擾。

2.1.3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5針，記錄色譜圖，計(jì)算維生素B12峰面積平均值及RSD值，RSD值應(yīng)不大于2.0%。理論塔板數(shù)以維生素B12峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000，維生素B12與未知峰之間的分離度應(yīng)該大于1.0。

表2 色譜條件

表3 梯度比例

2.1.3.3 供試品溶液的測(cè)定

取供試品溶液，每份溶液進(jìn)樣1針，記錄色譜圖。

2.1.4 計(jì)算與結(jié)果判斷

以外標(biāo)法計(jì)算：

式中——連續(xù)5針對(duì)照品溶液主峰平均峰面積；

Ax——供試品溶液主峰峰面積；

Cr——對(duì)照品溶液的濃度，mg/mL；

mr——標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量，mg。

每瓶注射用水溶性維生素中含維生素B12應(yīng)為4.5～6.0μg。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注射用水溶性維生素的兩種配制方法中，維生素B12的含量測(cè)定結(jié)果如表4所示。

2.3 液相圖譜

對(duì)每批樣品都做了兩遍平行實(shí)驗(yàn)，從液相圖譜（由于篇幅有限，本文不再贅述）中可以看出，得出的結(jié)果是一致的，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果是可靠的。

3 結(jié)語(yǔ)

從以上分析結(jié)果可以看出，配制方法1明顯優(yōu)于方法2，說(shuō)明維生素C鈉可能影響維生素B12的穩(wěn)定性。此外，在方法1中主要控制了維生素C鈉溶液的溫度以及維生素C鈉溶液加入維生素B12混合前的溫度，這樣可以極大地避免維生素C鈉對(duì)維生素B12造成損害，說(shuō)明方法1的配制工藝科學(xué)、合理、有效，既能生產(chǎn)出合格穩(wěn)定的產(chǎn)品，又能降低生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，幫助企業(yè)提高經(jīng)濟(jì)效益。

表4 注射用水溶性維生素的兩種配制方法結(jié)果

從表4可以看出：用方法1配制出來(lái)的注射用水溶性維生素中的B12含量基本上能夠達(dá)到5.0μg以上；而用方法2配制出來(lái)的注射用水溶性維生素中的B12含量基本上都未能夠達(dá)到5.0μg。由此說(shuō)明，配制方法1明顯優(yōu)于方法2。