張玉蓮

（上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，上海200001）

0 引言

高效液相色譜法是以液體為流動(dòng)相，采用高壓泵輸送，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分經(jīng)選擇性作用被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析[1]?，F(xiàn)今，高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于中藥材含量的檢測(cè)等領(lǐng)域。在測(cè)量中，為評(píng)估測(cè)量方法的可靠性和測(cè)量結(jié)果的可信程度，需要對(duì)測(cè)量的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)量的不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性。測(cè)量的不確定度越小，測(cè)量的可靠性越大[2]。

本文通過(guò)建立高效液相色譜法測(cè)定含量的不確定度評(píng)定方法，對(duì)梔子苷含量測(cè)定的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 梔子藥材

梔子藥材為浙江溫州基地直接購(gòu)買(mǎi)，并經(jīng)上海市中藥行業(yè)專家張?jiān)隽祭蠋熻b定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis[3]。

1.1.2 主要試劑

乙腈、甲醇（色譜級(jí)），購(gòu)自德國(guó)默克公司。

1.2 主要儀器

Agilent1200Series高效液相色譜儀，安捷倫公司；METTLERTOLEDOXS205DU分析天平，梅特勒-托利多公司；Milli-QReference純水機(jī)，密理博公司。

1.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（15:85）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm。理論塔板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理20min，放冷；再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液10mL，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

本品按干燥品計(jì)算，含梔子苷（C17H24O10）不得少于2.0%[3]。

3 不確定度來(lái)源和不確定度分量評(píng)定

3.1 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中梔子苷的含量M（%）

式中M——樣品中梔子苷的含量（%，g/100g）；

C——標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度，mg/mL；

V——供試品溶液的稀釋倍數(shù)；

W——供試品的稱樣量，g；

A樣——供試品峰面積；

A對(duì)——對(duì)照品峰面積。

3.2 不確定度的來(lái)源分析

從樣品實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程分析來(lái)看，高效液相色譜法測(cè)定梔子苷含量引入的不確定度因素主要有以下幾個(gè)方面：對(duì)照品溶液的濃度、供試品溶液的濃度、高效液相色譜法測(cè)定時(shí)的重復(fù)性。

其中：（1）對(duì)照品溶液濃度產(chǎn)生的不確定度因素主要包括對(duì)照品的純度、對(duì)照品稱量、對(duì)照品配制；（2）供試品溶液濃度產(chǎn)生的不確定度因素主要包括供試品稱量、供試品提取、供試品配制；（3）高效液相色譜法測(cè)定時(shí)的不確定度因素主要包括儀器測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度。

圖1為梔子苷含量測(cè)量的不確定度因素分析。合成不確定度urel（M）

式中urel（1）——對(duì)照品溶液濃度引入的不確定度；

urel（2）——供試品溶液濃度引入的不確定度；

urel（3）——重復(fù)性測(cè)量制備引入的不確定度。

3.3 分量的計(jì)算

3.3.1 對(duì)照品溶液濃度引入的不確定度

對(duì)照品溶液濃度引入的不確定度因素包括：對(duì)照品純度、對(duì)照品稱量、對(duì)照品配制過(guò)程。

對(duì)照品溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（1）=

3.3.1.1 對(duì)照品純度引入的不確定度

圖1 梔子苷含量測(cè)量的不確定度因素分析

經(jīng)查本次實(shí)驗(yàn)用的梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-201718，中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度97.6%），對(duì)照品未給出不確定度，該項(xiàng)忽略，即對(duì)照品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（純度）=0。3.3.1.2 對(duì)照品稱量引入的不確定度

（1）天平型號(hào)為METTLERTOLEDOXS205DU，稱取對(duì)照品15.27mg。經(jīng)查電子天平的檢定證書(shū)，電子天平的稱量擴(kuò)展不確定度為0.36mg（k=2），即稱量不確定度

（2）由于去皮稱量，故示值誤差的不確定度可以抵消，即示值不確定度u2=0。

（3）天平示值重復(fù)性不確定度，連續(xù)稱重10mg的標(biāo)準(zhǔn)砝碼10次，得到電子天平稱量的重復(fù)性不確定度u3=0.01068mg。

（4）由于去皮稱量，必須計(jì)算兩次：

稱重標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為標(biāo)準(zhǔn)不確定

度除以稱量，得

3.3.1.3 對(duì)照品溶液的制備過(guò)程引入的不確定度

對(duì)照品濃度為30μg/mL，配制時(shí)先稀釋至50mL容量瓶中，再吸取1mL稀釋至10mL容量瓶中。該部分引入的不確定度因素主要有以下幾個(gè)方面：玻璃容器的校準(zhǔn)、溫度效應(yīng)、定容重復(fù)性。

（1）由玻璃容器校準(zhǔn)引入的不確定度：

20℃時(shí)，50mL（A級(jí)）容量瓶最大允差為±0.05mL，10mL（A級(jí)）容量瓶最大允差為±0.02mL，1mL移液槍的最大允差為±1μL，按矩型分布，取k=

50mL容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V50）=

10mL容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V10）=

1mL移液槍校準(zhǔn)引入的不確定度u1（V1）=

（2）由溫度效應(yīng)引入的不確定度：

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)室的溫差為±2℃，假設(shè)矩形分布，取k=水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4。

50mL容量瓶溫度效應(yīng)引入的不確定度u2（V50）=

10mL容量瓶溫度效應(yīng)引入的不確定度u2（V10）=

1mL移液槍溫度效應(yīng)引入的不確定度u2（V1）=

（3）由定容體積重復(fù)性引入的不確定度：

對(duì)50mL、10mL容量瓶、1mL移液槍加水定容至刻度，連續(xù)操作10次，稱重得到：

50mL容量瓶定容重復(fù)性引入的不確定度u3（V50）=0.0391mL；

10mL容量瓶定容重復(fù)性引入的不確定度u3（V10）=0.0070mL；

1mL移液槍定容重復(fù)性引入的不確定度u3（V1）=0.0008mL。

（4）對(duì)照品溶液的制備過(guò)程引入的不確定度結(jié)果：

對(duì)照品溶液的制備過(guò)程中，50mL容量瓶引入的 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 ：u

容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為標(biāo)準(zhǔn)不確定度除以標(biāo)示容量，得：制備過(guò)程50mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V50）

對(duì)照品溶液的制備過(guò)程中，10mL容量瓶引入標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 ：u

制備過(guò)程10mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

對(duì)照品溶液的制備過(guò)程中，1mL移液槍引入的標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 ：u

制備過(guò)程1mL移液槍引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

對(duì)照品配制過(guò)程的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3.1.4 對(duì)照品溶液濃度引入的不確定度分量

對(duì)照品溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

3.3.2 供試品溶液濃度引入的不確定度

3.3.2.1 供試品溶液稱量引入的不確定度

（1）所用天平為METTLERTOLEDOXS204，稱取0.10g。經(jīng)查天平檢定證書(shū)，電子天平的稱量擴(kuò)展不確定度為0.36mg（k=2），稱量不確定度u10.18mg。

（2）由于去皮稱量，故示值誤差的不確定度可以抵消，即示值不確定度u2=0。

（3）天平示值重復(fù)性誤差，取0.1g標(biāo)準(zhǔn)砝碼連續(xù)稱重10次，得到電子天平稱量的不確定度u3=0.03162mg。

（4）由于去皮稱量，必須計(jì)算兩次：

稱重引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定u（稱量）=

稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（稱量0.0026。

3.3.2.2 供試品提取引入的不確定度

供試品提取所產(chǎn)生的回收率有著不確定性。由于樣品提取不完全，使得梔子苷不能被全部提取到溶液中，因此采用加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)試6次，測(cè)得供試品提取回收率分別為98.6%、99.0%、99.1%、98.7%、99.5%、100.1%，按極差法計(jì)算：

供試品提取引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（提取）=

3.3.2.3 供試品配制過(guò)程引入的不確定度

供試品配制階段，需使用25mL容量瓶、25mL移液管和10mL移液管，此過(guò)程的不確定度分量計(jì)算如下：

（1）由玻璃容器校準(zhǔn)引入的不確定度：

20℃時(shí)，25mL（A級(jí)）容量瓶最大允差為±0.03mL，25mL移液管的最大允差為±0.01mL，10mL移液管的最大允差為±0.02mL，按矩型分布，取k=

25mL容量瓶校準(zhǔn)引入的不確定度u容1（V25）=

25mL移液管校準(zhǔn)引入的不確定度u移1（V25）=

（2）由溫度效應(yīng)引入的不確定度：

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)室的溫差為±2℃，假設(shè)矩形分布，取k=

10mL移液管校準(zhǔn)引入的不確定度u移1（V10）=水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4。

25mL容量瓶溫度效應(yīng)引入的不確定度u容2（V25）=

25mL移液管溫度效應(yīng)引入的不確定度u移2（V25）=

10mL移液管溫度效應(yīng)引入的不確定度u移2（V10）=

（3）由定容體積重復(fù)性引入的不確定度：

對(duì)25mL容量瓶、25mL移液管和10mL移液管，加水定容至刻度，連續(xù)操作10次，稱重得到：

25mL容量瓶定容重復(fù)性引入的不確定度u容3（V25）=0.0213mL；

25mL移液管定容重復(fù)性引入的不確定度u移3（V25）=0.0079mL；

10mL移液管定容重復(fù)性引入的不確定度u移3（V10）=0.0095mL。

（4）供試品配制過(guò)程引入的不確定度：

供試品配制過(guò)程中，25mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度 ：u容配制過(guò)程中25mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

供試品配制過(guò)程中，25mL移液管引入的標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度 ：u移配制過(guò)程中25mL移液管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

供試品配制過(guò)程中，10mL移液管引入的標(biāo)準(zhǔn)不 確 定 度 ：u移配制過(guò)程中10mL移液管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

供試品溶液配制過(guò)程合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3.2.4 供試品溶液濃度引入的不確定度分量

供試品溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

3.3.3 儀器重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度

對(duì)同一樣品連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定得到梔子苷的含量分別為3.53%、3.58%、3.61%、3.60%、3.58%、3.62%，測(cè)量平均值=3.59%，極差為0.09%。

按平均值=3.59%計(jì)算重復(fù)性測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

3.3.4 梔子苷含量測(cè)量的相對(duì)合成不確定度

梔子苷含量測(cè)量的相對(duì)合成不確定度：

4 結(jié)果與討論

4.1 結(jié)果

梔子苷含量測(cè)量的不確定度結(jié)果如下：

（1）測(cè)量平均值M=3.59%；

（2）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc（M）=M×uc，rel（M）=3.59%×0.0210=0.08%；

（3）擴(kuò)展不確定度：在95%置信概率下，取包含因子k=2，將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子計(jì)算得到測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度：U=k×uc（M）=2×0.08%=0.16%；

（4）被測(cè)梔子藥材中梔子苷的含量為3.59%±0.16%，k=2。

4.2 討論

（1）在不確定度評(píng)估中，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程充分考慮各個(gè)影響因素[4]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)對(duì)梔子苷含量測(cè)定的各不確定度分量進(jìn)行分析評(píng)估，在影響梔子苷含量測(cè)定不確定度的各因素中，對(duì)照品稱量、重復(fù)性測(cè)量、供試品溶液的提取引入的不確定度對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響較大。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)稱量過(guò)程、儀器性能狀態(tài)以及樣品溶液提取過(guò)程的控制。

（2）在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，溫度效應(yīng)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)中使用的玻璃容器帶來(lái)不確定度，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制檢測(cè)環(huán)境的溫度波動(dòng)。

（3）對(duì)照品純度的不確定度也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)未提供不確定度，故本實(shí)驗(yàn)忽略該項(xiàng)因素。

[1]武漢大學(xué)化學(xué)系.儀器分析[M].北京：高等教育出版社，2001.

[2]化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南：CNAS-GL06[S].

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[4]王維劍，凌霄，譚會(huì)潔，等.HPLC法測(cè)定中藥中摻入雙氯芬酸鈉含量的不確定度評(píng)定[J].藥物分析雜志，2009，29（1）：130-133.