姜依何，胥偉，朱旗*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

真菌毒素（Mycotoxins）是由真菌（Fungi）產(chǎn)生的一類(lèi)具有細(xì)胞、器官或機(jī)體毒性的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于食品和飼料中，主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉素、伏馬毒素、單端孢霉烯族毒素等種類(lèi)[1-4]。真菌毒素的研究范圍集中于產(chǎn)毒菌株的確證[5]、生物合成通路的解析[6]、產(chǎn)毒條件的研究[7]、暴露值的評(píng)估[8]、生物毒理性影響[9]、共軛型隱蔽毒素的分析[10]、檢測(cè)技術(shù)的建立[11-13]、脫毒（或解毒）材料的篩選和方法的建立[14]等，為降低食品風(fēng)險(xiǎn)、減少危害提供理論及技術(shù)支持，在保障食品安全方面具有重要意義。

近年來(lái)隨著消費(fèi)者對(duì)純天然飲品需求量的增加及茶葉保健功效的不斷深入研究，特別是在減肥降脂[15]、調(diào)理代謝[16]等方面生物活性的科學(xué)確證，使得全球范圍內(nèi)茶葉消費(fèi)量得到不斷提高。在茶葉加工過(guò)程中，以微生物胞外酶催化為主導(dǎo)作用促進(jìn)品質(zhì)轉(zhuǎn)化形成其特有品質(zhì)風(fēng)格的茶類(lèi)為黑茶?，F(xiàn)有黑茶微生物的研究已明確曲霉屬真菌（2013年，散囊菌屬的部分菌株已移入曲霉屬，冠突散囊菌即在此列[17]）為黑茶發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群[18-20]。而從食品安全的角度考慮，曲霉屬（Aspergillus）真菌可產(chǎn)生多種真菌毒素，如：黃曲霉毒素（Aflatoxins）[21]、赭曲霉素（Ochratoxins）[4]、橘霉素（Citrinin）[21-22]、環(huán)匹阿尼酸（Cyclopiazonic acid）[23]、棒曲霉素（Patulin）[24]、青霉酸（Penicillic acid）[25]等。由于黑茶可長(zhǎng)期儲(chǔ)存的特性，從貯存的角度考慮，有研究表明該階段有青霉屬（Penicillium）真菌存在[26-27]，青霉屬真菌亦可產(chǎn)生多種真菌毒素，除上述真菌毒素之外[28]，還存在如下數(shù)種：婁地青霉素C（Roquefortine C）[29]、PR毒素（PR-toxin）[4]等。

在已有的研究中，雖無(wú)直接研究成果證明黑茶的真菌毒素暴露水平對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生了毒理性影響，但部分學(xué)者已經(jīng)報(bào)道了黑茶真菌毒素方面的研究成果。特別是近期針對(duì)真菌污染黑茶可能產(chǎn)生的有害微生物及其毒素爭(zhēng)論較激烈，如何客觀的認(rèn)識(shí)該問(wèn)題，本文介紹了幾種已在黑茶樣本中研究的真菌毒素類(lèi)型、形成的條件及檢測(cè)方法，以期為食品安全政策制定者和科研人員提供參考。

1 黃曲霉毒素（Aflatoxins）

1.1 黃曲霉毒素概況

黃曲霉毒素是一類(lèi)由黃曲霉（Aspergillusflavus，產(chǎn)毒菌株占 40%~50%[30]）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus，產(chǎn)毒菌株約占90%[30]）產(chǎn)生的具有生物毒性的次生代謝產(chǎn)物[31]。依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，黃曲霉素又分為 B1、B2、G1、G2、M1、M2等數(shù)種類(lèi)型，其中以 AFB1（Aflatoxin B1, AFB1）的毒性最大[32]，其生物合成通路見(jiàn)圖 1，AFM1和 AFM2是哺乳動(dòng)物攝入黃曲霉素后在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成的一類(lèi)物質(zhì)[33]。不像寄生曲霉鮮見(jiàn)于東南亞，黃曲霉分布廣泛[30]，因此，黑茶中黃曲霉素的研究主要針對(duì)黃曲霉污染后在黑茶上的生長(zhǎng)及生物合成。

1.2 黃曲霉外源污染黑茶基質(zhì)

在現(xiàn)有的黑茶微生物群落組成研究中，暫未發(fā)現(xiàn)有黃曲霉的報(bào)道[34]。但從外源接種的角度來(lái)講，茶葉樣本如若經(jīng)過(guò)潮水使得茶葉含水量達(dá)到渥堆水平時(shí)，黃曲霉存在在該基質(zhì)上生長(zhǎng)的可能[35-36]；如若僅接種而不潮水，黃曲霉則無(wú)法在該基質(zhì)生長(zhǎng)[35]。這表明，茶葉樣本含水量是黃曲霉是否在茶葉基質(zhì)上生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，但添加黑茶水浸出物（有研究直接添加茶多酚[37]）的培養(yǎng)基能顯著地抑制黃曲霉在平板上的生長(zhǎng)[38]。在對(duì)茶葉生產(chǎn)環(huán)境中的真菌多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)茶葉加工空氣中有黃曲霉菌株的存在[39]，表明在黑茶生產(chǎn)的過(guò)程中存在黃曲霉菌污染的可能。從黑茶等溫吸濕模型可以看出[40]，在允許的時(shí)間范圍內(nèi)，空氣濕度直接決定了倉(cāng)儲(chǔ)期的黑茶平衡含水率，從理論上來(lái)講，黃曲霉在高濕條件下便有侵染黑茶基質(zhì)的可能。

1.3 黃曲霉外源污染黑茶的毒素暴露水平

出于黑茶發(fā)酵過(guò)程真菌體系復(fù)雜的考慮，多種真菌毒素檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到了黑茶樣本中。雖然有研究報(bào)道了黑茶中存在黃曲霉毒素的可能[11,41-46]，但檢出陽(yáng)性結(jié)果的方法多來(lái)自于酶聯(lián)免疫檢測(cè)法，由于茶葉中含有大量的多酚類(lèi)物質(zhì)、黑茶中的茶色素以及其他干擾物質(zhì)，使得該種檢測(cè)方法在檢測(cè)真菌毒素的測(cè)試中被廣泛地認(rèn)定存在假陽(yáng)性結(jié)果的可能[47]，測(cè)試技術(shù)發(fā)展到如今，該方法已被淘汰，其陽(yáng)性結(jié)果也需要進(jìn)行色譜確證。目前使用高效液相色譜聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)茶葉樣品中黃曲霉毒素有選擇性好、且得到的試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸取代傳統(tǒng)的液相色譜方法[48]。使用上述兩種檢測(cè)方法研究黑茶樣品中黃曲霉毒素的結(jié)果也有報(bào)道，劉妍等[44]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測(cè)了 10份普洱茶樣，其中有兩份檢出 AFB1，含量分別為 3.1 ng·g-1和 7.5 ng·g-1。吳靜等[49]采用IAC-HPLC的方法檢測(cè)了60份普洱茶樣品，AFB1含量范圍在 0.236~8.452 ng·g-1，88.3%的樣 品 低 于 5 ng·g-1。 Doris Haas[26]、 Sofie Monbaliu[50]和 B. Romagnoli[51]則均未檢出黃曲霉毒素。上述結(jié)果表明，黃曲霉毒素并非廣泛存在于黑茶樣品中，而存在黃曲霉毒素陽(yáng)性結(jié)果的黑茶樣品中含量亦遠(yuǎn)低于日本報(bào)道的20世紀(jì)90年代日常植物性食物黃曲霉毒素的含量（10~4 918 ng·g-1）[52]，由于黃曲霉毒素難溶于水，黃曲霉毒素從茶葉到茶湯的轉(zhuǎn)移率也是極低的。因此，黑茶的黃曲霉素暴露處于較低水平，黃曲霉毒素污染所導(dǎo)致的食品安全風(fēng)險(xiǎn)極低。

圖1 黃曲霉毒素生物合成通路示意圖Fig. 1 The diagram of biosynthesis pathway of aflatoxins

1.4 茶葉基質(zhì)對(duì)黃曲霉素合成途徑的影響

茶葉基質(zhì)成分具有很強(qiáng)的特殊性和復(fù)雜性，內(nèi)含有豐富的咖啡堿、茶色素、多酚類(lèi)等物質(zhì)，這些成分是茶葉具有健康功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[53]，在外源污染真菌侵染的情況下，此類(lèi)次生代謝產(chǎn)物同時(shí)具有抑制或制止霉菌產(chǎn)生真菌毒素的能力。李亞莉等[54]通過(guò)接種外源產(chǎn)毒黃曲霉于普洱茶基質(zhì)上，并在高溫高濕條件下培養(yǎng)和倉(cāng)儲(chǔ)，在一定的陳化期后進(jìn)行樣品檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有產(chǎn)毒能力的黃曲霉在普洱茶基質(zhì)上未產(chǎn)生黃曲霉毒素。這表明，黑茶基質(zhì)中的某些成分具有抑制黃曲霉毒素合成的能力。H.Z.Mo等[55]和吳清華[56]通過(guò)半定量PCR技術(shù)研究了普洱茶對(duì)黃曲霉毒素合成過(guò)程的影響，結(jié)果表明，普洱茶基質(zhì)能通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄黃曲霉毒素基因家族的AflS和AflR來(lái)減少黃曲霉毒素的生物合成，AflS和AflR通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)酯鍵水解酶（Est A），該酶是黃曲霉毒素合成過(guò)程的限速酶，該酶的表達(dá)減量抑制了VHA甲氧基酯鍵的水解形成VAL的過(guò)程，但下調(diào)表達(dá)相關(guān)基因的分子機(jī)理未得到明確闡述。張浩等[57]認(rèn)為茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)槲皮素是抑制黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的活性因子，該物質(zhì)通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子Yap 1誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)AflS和AflR基因。普洱茶不僅具有抑制黃曲霉產(chǎn)生毒素的能力，而且在普洱茶抗突變的研究中顯示，普洱茶水提物甚至具有拮抗黃曲霉毒素誘導(dǎo)突變的能力[58]。

2 赭曲霉素（Ochratoxins）

2.1 赭曲霉素概況

赭曲霉素最初發(fā)現(xiàn)由赭曲霉代謝產(chǎn)生[59]，后研究表明是一類(lèi)由曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）真菌[60]產(chǎn)生的具有致畸、致癌、免疫抑制、肝臟毒性及嚴(yán)重腎毒性的次生代謝產(chǎn)物[61-62]?，F(xiàn)國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)認(rèn)定其為2B類(lèi)致癌物[63]，依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，赭曲霉素又分為A、B、α、β等數(shù)種類(lèi)型，其中以O(shè)chratoxin A（Ochratoxin A, OTA）的毒性最大[64-65]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑[60]見(jiàn)圖2。

2.2 黑茶赭曲霉素暴露水平

不像黃曲霉鮮見(jiàn)于黑茶基質(zhì)，曲霉屬真菌和青霉屬真菌在黑茶微生物研究中被廣泛檢出[34,66]，部分研究論文明確報(bào)道了黑茶基質(zhì)中赭曲霉的存在[67]，并檢測(cè)了赭曲霉素含量為 1.8 ng·g-1。劉妍等[45]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)從10份黑茶樣本中檢出1份含有赭曲霉素，含量為 4.2 ng·g-1。Sofie Monbaliu等[41]則報(bào)道了茶葉中的赭曲霉素含量范圍為2~10 ng·g-1，沖泡后的茶湯中的含量范圍為0.5~2 ng·mL-1。Doris Haas 等[26]從 36 份普洱茶樣品中檢出了4份樣本含赭曲霉素，含量分別為 0.65、0.65、14.8、94.7 ng·g-1，并認(rèn)為黑茶樣本中含量最高的OTA可能由樣本中青霉屬真菌代謝產(chǎn)生。莫瑾等[68]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了19份普洱茶樣品，結(jié)果均未檢出 OTA。J.M. Mogensen等[19]采用HPLC方法檢測(cè)的市售的普洱茶和紅茶樣本，結(jié)果亦均未檢出 OTA。上述結(jié)果表明，OTA并非廣泛存在于黑茶樣品中，檢出陽(yáng)性樣本的OTA含量在0.5~94.7 ng·g-1，這與外源污染真菌的種類(lèi)有著直接的聯(lián)系。黑茶中赭曲霉素相關(guān)研究較少，可能與其毒素等級(jí)有關(guān)。由于赭曲霉素來(lái)源廣泛，且曲霉素和青霉屬真菌是其主要的來(lái)源，而此類(lèi)真菌與黑茶品質(zhì)形成有著密不可分的聯(lián)系。因此，赭曲霉素在黑茶中存在的狀態(tài)值得進(jìn)一步關(guān)注。

3 嘔吐毒素（Deoxynivalenol）

3.1 嘔吐毒素概況

嘔吐毒素，學(xué)名：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生[69]的一類(lèi)能夠引起動(dòng)物或人類(lèi)嘔吐、腹瀉甚至腸道壞死的次生代謝產(chǎn)物，歐盟將其定義為三級(jí)致癌物[70]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑[71]見(jiàn)圖3。

圖2 赭曲霉素結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑Fig. 2 Constitutional formula and biosynthetic pathway of ochratoxins

3.2 嘔吐毒素在黑茶樣品中的暴露水平

不像曲霉屬真菌和青霉屬真菌在黑茶中廣泛存在，鐮刀菌屬真菌在黑茶微生物多樣性研究中較少檢出，僅趙仁亮報(bào)道了鐮刀菌的產(chǎn)生[72]，陳建玲等[43]采用酶聯(lián)免疫的方法對(duì)廣州市場(chǎng)上的 70份普洱茶樣本進(jìn)行了 DON含量的檢測(cè)，其含量范圍為357~3107 ng·g-1，其中超過(guò) 1 000 ng·g-1的樣本有 63份。吳靜[49]采用酶聯(lián)免疫的方法對(duì)60份普洱茶樣本進(jìn)行了DON含量的檢測(cè)，其含量范圍為347~3 005 ng·g-1，其中超過(guò) 1 000 ng·g-1的樣本有 41 份。如前文所述，酶聯(lián)免疫在黑茶樣本中由于多酚類(lèi)物質(zhì)及其他次生代謝產(chǎn)物的干擾，假陽(yáng)性結(jié)果存在普遍性，結(jié)果僅能做為初篩結(jié)果，需進(jìn)行色譜確證。劉妍等[73]基于此，開(kāi)發(fā)了針對(duì)黑茶樣本的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測(cè)了黑茶樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所檢的 61份黑茶樣品中，嘔吐毒素檢出3份，檢出率為4.9%，其含量分別為 8.6、70.1、299.5 ng·g-1，色譜數(shù)據(jù)所檢出結(jié)果低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 2761—2017[74]中對(duì)谷物及制品的限量要求1 000 ng·g-1，表明黑茶中DON的暴露水平值低。由于黑茶中真菌毒素研究的相關(guān)報(bào)道較少，而嘔吐毒素又在黑茶中有檢出，因此相關(guān)研究是今后黑茶食品安全研究的方向之一。

圖3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑Fig. 3 Constitutional formula and biosynthetic pathway of Deoxynivalenol（DON）

4 討論與展望

我國(guó)黑茶生產(chǎn)體系中真菌多樣性豐富，種類(lèi)復(fù)雜的微生物在它們的共同作用下形成了不同地域不同風(fēng)格的黑茶類(lèi)產(chǎn)品。但由于黑茶產(chǎn)品從原料存放、生產(chǎn)加工、產(chǎn)品儲(chǔ)藏、物流運(yùn)輸、商品貯存到最后的消費(fèi)需要經(jīng)歷一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，如在不規(guī)范生產(chǎn)或貯存的情況下，黑茶產(chǎn)品存在產(chǎn)毒真菌菌株污染并產(chǎn)生真菌毒素的可能。本文通過(guò)對(duì)黑茶類(lèi)產(chǎn)品真菌毒素的研究成果進(jìn)行歸納總結(jié)，提示了不規(guī)范的生產(chǎn)方式和消費(fèi)方式可能存在的安全風(fēng)險(xiǎn)，以期為企業(yè)生產(chǎn)和消費(fèi)者飲用提供參考。

黑茶的生產(chǎn)與飲用歷經(jīng)千年，還未曾報(bào)道過(guò)流行病學(xué)顯示的黑茶產(chǎn)品的安全性風(fēng)險(xiǎn)。雖然我們?cè)诂F(xiàn)有的研究手段下，檢測(cè)到非規(guī)范生產(chǎn)或貯存下的產(chǎn)品存在污染真菌菌株在黑茶基質(zhì)上生長(zhǎng)的現(xiàn)象，也檢測(cè)出存在有真菌毒素的可能，表明標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化生產(chǎn)黑茶是非常必要的，生產(chǎn)貯存全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[75-76]。

原料存放：由于黑茶原料的存放比較粗放，使用包裝材料沒(méi)有嚴(yán)格要求，但作為食品加工，黑茶包裝應(yīng)嚴(yán)格使用專(zhuān)用食品包裝袋，忌用其他用途的包裝袋，特別是采用舊飼料包裝袋或糧油種子包裝袋打包黑茶原料的做法，以防止有害微生物的交叉污染；同時(shí)，倉(cāng)庫(kù)管理上要留意氣溫和濕度的變化，防止原料在存放過(guò)程中發(fā)生霉變。

生產(chǎn)加工：要設(shè)定安全的渥堆場(chǎng)地，嚴(yán)格控制生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)。把握好渥堆原料的大小，茶葉含水量的高低，渥堆時(shí)間等因素從而促進(jìn)有益微生物的生長(zhǎng)，抑制有害菌的生長(zhǎng)；不能有急功近利、唯利是圖的思想，采用不合理的生產(chǎn)方式，如高含水量和短時(shí)渥堆等錯(cuò)誤方式，以免有害微生物滋生，影響產(chǎn)品的安全性；茯磚茶的發(fā)花工藝要嚴(yán)格控制好初始含水量及烘焙過(guò)程中的烘房?jī)?nèi)的溫濕度等參數(shù)，時(shí)刻抽檢在制品的發(fā)花進(jìn)程，保證有益微生物的正常生長(zhǎng)和培育。

產(chǎn)品貯存：黑茶產(chǎn)品通過(guò)陳放可改善其滋味，提高品質(zhì)，但一定要避免不規(guī)范的濕倉(cāng)做老，加水做陳等影響品質(zhì)安全性的方式。實(shí)際上，高濕條件的產(chǎn)品貯存不但無(wú)法提高產(chǎn)品品質(zhì)，相反極易造成受有害微生物的侵染，滋生多種有害霉菌[77]，導(dǎo)致茶葉品質(zhì)劣變，甚至不能飲用。消費(fèi)者自藏黑茶產(chǎn)品要嚴(yán)格保證存放條件，忌水、忌潮、忌異味。

另外，相關(guān)研究結(jié)果表明，黑茶多種品質(zhì)成分具有抑制菌株生長(zhǎng)或產(chǎn)毒的能力，而且已知的真菌毒素多為不溶于水或微溶于水的次生代謝物，對(duì)于只飲茶湯不食茶葉的消費(fèi)方式來(lái)說(shuō)，更加確保了黑茶產(chǎn)品飲用的安全性。因此，良好的生產(chǎn)規(guī)范和合理的貯存方式是黑茶安全生產(chǎn)的前提，根據(jù)黑茶加工技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，真菌污染是可以避免的，消費(fèi)者通過(guò)正規(guī)渠道購(gòu)買(mǎi)正規(guī)廠(chǎng)家生產(chǎn)的產(chǎn)品是安全的。

雖然黑茶類(lèi)產(chǎn)品因污染真菌而導(dǎo)致的安全風(fēng)險(xiǎn)極低，但不規(guī)范的生產(chǎn)和儲(chǔ)運(yùn)方式仍存在增加黑茶產(chǎn)品感染污染真菌的風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)際上對(duì)發(fā)酵類(lèi)食品的微生物菌種管理非常嚴(yán)格，如美國(guó)的GRAS（Generally recognized as safe）評(píng)價(jià)體系和歐洲的QPS（Qualified presumption of safety）評(píng)價(jià)體系對(duì)食品用菌種的名單列表、審批程序、安全性評(píng)估、合理使用和監(jiān)管都有嚴(yán)格的規(guī)定[78-86]。參照發(fā)酵食品加工的管理和監(jiān)控經(jīng)驗(yàn)，完善黑茶生產(chǎn)過(guò)程中的檢測(cè)和檢驗(yàn)手段及方法，應(yīng)是今后黑茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展要加強(qiáng)的方面。同時(shí)，現(xiàn)代發(fā)酵食品生產(chǎn)理念要求對(duì)食品中存在的微生物要明確其菌種信息并清晰其在食品加工過(guò)程中所發(fā)揮的作用。因此，精確解析黑茶加工過(guò)程中有害微生物的產(chǎn)生條件和有毒菌株的產(chǎn)毒可能性，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)食品工程的加工原理，嚴(yán)格篩選可用于黑茶發(fā)酵生產(chǎn)的有益菌種，實(shí)現(xiàn)黑茶加工精準(zhǔn)定向發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用和推廣也應(yīng)是黑茶生產(chǎn)努力的方向。

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