陳建茹，董偉偉，彭娟，焦曉林，吳馨琰，高微微*

(1.上海同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，上海 201707；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

柏子仁為柏科Cupressaceae植物側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥成熟種仁，具有養(yǎng)心安神，潤(rùn)腸通便，止汗的功效[1]。柏子仁含豐富的油脂，在儲(chǔ)藏過(guò)程中受環(huán)境條件的影響，極易出現(xiàn)泛油、霉變等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響柏子仁的品質(zhì)[2]。為了保障用藥安全，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版新增了對(duì)柏子仁藥材及飲片黃曲霉毒素檢查項(xiàng)目，規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)為黃曲霉毒素B1(AFB1) ≤5 μg·kg-1，黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1總量(AFs)≤ 10 μg·kg-1。我們查閱到有關(guān)柏子仁黃曲霉毒素污染調(diào)查的8篇報(bào)道中，總共23個(gè)批次，均有黃曲霉毒素檢出，其中20個(gè)批次超過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版限量標(biāo)準(zhǔn)，不合格率高達(dá)87%[3-10]，表明柏子仁黃曲霉毒素的污染問(wèn)題比較嚴(yán)重。

黃曲霉毒素主要由黃曲霉Aspergillusflavus和寄生曲霉A.parasiticus產(chǎn)生，其生物合成受到溫度、濕度等多種因子的影響[11-12]。目前對(duì)于中藥材包裝儲(chǔ)藏研究多關(guān)注于藥材性狀、有效成分的變化[13-15]，而儲(chǔ)藏條件對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生和積累的影響報(bào)道較少。對(duì)于已經(jīng)污染黃曲霉毒素的中藥材，如何通過(guò)有效的處理技術(shù)脫除毒素在中藥材領(lǐng)域極少有研究，雖然在食品、農(nóng)作物及飼料上有相關(guān)報(bào)道[16-18]，但這些方法是否適用于中藥材尚待研究。本文以黃曲霉毒素污染嚴(yán)重的柏子仁作為研究對(duì)象，分析對(duì)比在不同儲(chǔ)藏條件下柏子仁中黃曲霉毒素的變化，并采用不同脫除方法處理污染樣品，旨在為探尋柏子仁安全儲(chǔ)藏及黃曲霉毒素脫除方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試藥材

于2017年4月至10月期間，對(duì)市場(chǎng)收集的10個(gè)批次柏子仁進(jìn)行黃曲霉毒素污染情況的檢測(cè)。選擇有污染的樣品用于儲(chǔ)藏與脫毒試驗(yàn)。

1.2 儲(chǔ)藏試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將8 kg柏子仁樣品用塑料袋或真空包裝，分別放置于10 ℃低溫及25 ℃常溫2個(gè)貯藏庫(kù)。儲(chǔ)藏庫(kù)濕度各為65%和60%，分別于儲(chǔ)藏前及儲(chǔ)藏后1個(gè)月、2個(gè)月取樣，檢測(cè)柏子仁中黃曲霉毒素的含量。取樣時(shí)每個(gè)處理各取兩份樣品，每份樣品測(cè)定1次。

1.3 黃曲霉毒素脫除試驗(yàn)

分別采用溫水、75%乙醇處理柏子仁。取500 g柏子仁加入1000 mL 45 ℃溫水或75%乙醇，攪拌5 min，置于不銹鋼篩網(wǎng)上瀝干，80 ℃干燥3～4 h，晾涼，存放于潔凈的塑料袋中，待檢。

1.4 黃曲霉毒素提取及含量測(cè)定

樣品按四分法取45 g左右，粉碎，過(guò)24目篩。參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版通則2351第一法免疫親和柱凈化HPLC柱后光化學(xué)衍生化法測(cè)定黃曲霉毒素含量[19]。免疫親合柱購(gòu)于北京中科匯仁科技有限公司，高效液相色譜儀采用Agilent 1260，色譜柱采用C18反相硅膠柱(Agilent TC-C18(2)，4.6 mm×250 mm×5 μm)。色譜條件以甲醇-乙腈-水(20∶18∶62)為流動(dòng)相，流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。通過(guò)與已知濃度的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，濃度分別為2.04×10-3、0.86×10-3、2.12×10-3、0.76×10-3ng·mL-1)比較，計(jì)算柏子仁樣品中AFB1及AFs的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同批次柏子仁黃曲霉毒素污染量

10個(gè)批次柏子仁樣品中共有9批樣品檢出黃曲霉毒素。其中有5批次樣品超出《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版限量標(biāo)準(zhǔn)(AFB1≤ 5 μg·kg-1，AFs ≤ 10 μg·kg-1)，不合格率為50%(表1)。污染量最高的1批樣品(批號(hào)17-06-08-04)AFB1高達(dá)247.5 μg·kg-1，AFs為270.0 μg·kg-1。

表1 10批次柏子仁黃曲霉毒素檢測(cè)結(jié)果 μg·kg-1

注：ND表示未檢出。

2.2 不同儲(chǔ)藏條件下柏子仁的黃曲霉毒素含量

選擇17-07-01-01批次進(jìn)行儲(chǔ)藏試驗(yàn)。儲(chǔ)藏前的AFB1為3.2 μg·kg-1，AFs為3.9 μg·kg-1，均未超過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版限量標(biāo)準(zhǔn)。在10 ℃、25 ℃的溫度下儲(chǔ)藏1個(gè)月、2個(gè)月后，兩種包裝的所有樣品黃曲霉毒素的含量均有所增加，表現(xiàn)出隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)黃曲霉毒素積累的趨勢(shì)，25 ℃儲(chǔ)藏下的毒素增加量高于10 ℃(表2)。10 ℃貯藏條件下，儲(chǔ)藏1個(gè)月的柏子仁AFB1已經(jīng)超出藥典限量標(biāo)準(zhǔn)，在此時(shí)真空包裝與塑料袋包裝沒(méi)有明顯差別，AFB1的增加量為1.4和1.3倍，AFs的增加量為1.5倍和1.4倍；儲(chǔ)藏2個(gè)月時(shí)真空包裝的污染量高于塑料袋包裝，AFB1的增加量為4.5和2.7倍，AFs的增加量為4.3倍和2.3倍。25 ℃貯藏條件下，儲(chǔ)藏1個(gè)月后AFB1和AFs都超出標(biāo)準(zhǔn)，真空包裝的污染量高于塑料袋包裝，AFB1的增加量為5.1和2.0倍，AFs的增加量為6.3倍和2.2倍。儲(chǔ)藏2個(gè)月時(shí)，真空包裝的污染量則低于塑料袋包裝AFB1的增加量為5.4和8.3倍，AFs的增加量為7.8倍和4.9倍。

表2 不同儲(chǔ)藏條件下柏子仁的AFB1和AFs檢出量 μg·kg-1

注：表中數(shù)據(jù)為同一處理2次重復(fù)取樣測(cè)定的平均值。

2.3 不同處理對(duì)柏子仁黃曲霉毒素的脫除效果

75%乙醇洗和水洗對(duì)柏子仁中黃曲霉毒素具有一定脫除作用，脫除的效率存在差異。75%乙醇洗可使柏子仁樣品中AFB1由初始濃度52.6 μg·kg-1降低至5 μg·kg-1，脫除率為90.5%；AFs由初始濃度60.5 μg·kg-1，降低至5.8 μg·kg-1，脫除率為90.4%，處理后樣品黃曲霉毒素的含量降低至藥典限量標(biāo)準(zhǔn)以下(表3)。水洗對(duì)柏子仁AFB1的脫除率為87.7%；對(duì)AFs的脫除率為87.8%，處理后樣品黃曲霉毒素的含量仍高于藥典限量標(biāo)準(zhǔn)。

表3 不同方法處理柏子仁的黃曲霉毒素檢出量及脫除率

3 討論

10批次柏子仁的調(diào)查結(jié)果表明，柏子仁藥材中普遍存在黃曲霉毒素污染。郝愛(ài)魚(yú)等[3]調(diào)查了120批中藥飲片的黃曲霉毒素污染狀況，發(fā)現(xiàn)在各類藥材中種子類的污染率最高，達(dá)到30%以上，認(rèn)為種子類藥材被污染的程度嚴(yán)重，應(yīng)作為黃曲霉毒素監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)對(duì)象。種子類藥材含淀粉、蛋白、糖、脂類成分較多，有報(bào)道亞油酸的過(guò)氧化物通過(guò)作用于G蛋白信號(hào)通路刺激黃曲霉菌株產(chǎn)生黃曲霉毒素[20-21]；《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定了柏子仁中AFB1/AFs的限量標(biāo)準(zhǔn)，隨之相關(guān)的檢測(cè)數(shù)據(jù)開(kāi)始積累，綜合文獻(xiàn)報(bào)道及市場(chǎng)調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)柏子仁在種子類藥材中是污染最為嚴(yán)重的種類之一，推測(cè)柏子仁的脂類成分組成可能與其污染黃曲霉毒素嚴(yán)重有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本文涉及的兩個(gè)儲(chǔ)藏溫度10 ℃、25 ℃，兩種密封包裝條件下，柏子仁黃曲霉毒素在儲(chǔ)藏1個(gè)月后檢出量均有所增加。文獻(xiàn)報(bào)道A.flavus在花生上最低生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的溫度為13±1 ℃[22]，A.parasiticus的最低產(chǎn)毒溫度為10 ℃[23]。本實(shí)驗(yàn)儲(chǔ)藏柏子仁的低溫庫(kù)為10 ℃，在這個(gè)溫度下柏子仁中仍有毒素產(chǎn)生，提示我們柏子仁上污染菌的種類及其在藥材上的產(chǎn)毒特性值得進(jìn)一步研究。我們發(fā)現(xiàn)在真空包裝中柏子仁仍會(huì)發(fā)生黃曲霉毒素積累，這種現(xiàn)象在與其他一些飲片廠的交流過(guò)程中也被證實(shí)確實(shí)存在，原因一方面是污染菌在真空包裝中仍然存活，產(chǎn)毒真菌在不生長(zhǎng)的情況下仍然可以合成黃曲霉毒素，這一現(xiàn)象與劉光憲等[24]報(bào)道4種不同材料的包裝袋抽真空充CO2氣體貯藏花生后AFB1含量隨儲(chǔ)藏時(shí)間增加而積累的結(jié)果一致。另一方面的原因可能與柏子仁的化學(xué)成分有關(guān)，在無(wú)氧條件下柏子仁中含有的促進(jìn)黃曲霉毒素合成的成分如亞油酸、亞麻酸等相對(duì)穩(wěn)定[25-27]，而它們的氧化產(chǎn)物如13S-過(guò)氧羥基-9,11-十八碳二烯酸(13S-HPODE)、脂氧合物反而可通過(guò)抑制毒素合成基因簇上aflO、cypA、ordA、aflR、aflS等基因的表達(dá)從而抑制產(chǎn)毒[27-28]，因此無(wú)氧條件下真空包裝中柏子仁的黃曲霉毒素含量有可能高于非真空包裝。本研究結(jié)果與以往真空包裝有利于食品保藏的觀念有所不同，提示柏子仁的黃曲霉毒素污染可能有其特殊性，在今后的工作中有必要深入研究含氧量及藥材成分對(duì)黃曲霉毒素合成的影響及機(jī)制。

研究結(jié)果表明，75%乙醇洗、水洗等洗脫法對(duì)于柏子仁中黃曲霉毒素的去除具有一定效果，與文獻(xiàn)報(bào)道洗脫法可去除蓮子、玉米中黃曲霉毒素的結(jié)果相一致，羅小榮等[29]報(bào)道水洗法可將蓮子中黃曲霉毒素總量由75.16 μg·kg-1降低至31.05 μg·kg-1，脫毒率為59%；胡蘭[18]利用水洗法去除玉米中的黃曲霉毒素，平均去毒率在80%以上。本研究表明，75%乙醇比水對(duì)柏子仁中黃曲霉毒素具有更好的脫毒效果，原因可能由于黃曲霉毒素溶于乙醇而不溶于水，75%乙醇洗不僅可以通過(guò)溶劑沖洗產(chǎn)生的力脫除柏子仁表面的毒素，還可以溶解出一部分內(nèi)部的毒素，而水洗只產(chǎn)生前者作用。盡管如此，本實(shí)驗(yàn)中75%乙醇洗和水洗的脫毒率均達(dá)不到100%，說(shuō)明柏子仁一旦污染黃曲霉毒素很難完全去除，尤其對(duì)于污染嚴(yán)重的樣品，即使脫除了大部分毒素，脫毒后的樣品可能仍高于藥典的限量要求。從安全、經(jīng)濟(jì)的角度考慮，作者認(rèn)為防毒應(yīng)比脫毒更重要，如何避免產(chǎn)毒真菌的污染將是今后工作的重點(diǎn)。本研究初步探討了柏子仁中黃曲霉毒素的脫除方法，關(guān)于脫除方法對(duì)柏子仁藥理活性是否存在影響及更高效的脫除技術(shù)等還有待于進(jìn)一步研究和探索。研究的結(jié)果可為其他種子類藥材的相關(guān)研究提供借鑒與參考，尤其是《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版已制訂黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的酸棗仁、桃仁、蓮子、肉豆蔻、決明子、薏苡仁等品種。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：247-248.

[2] 何嫩艷.幾種易泛油霉變的藥材簡(jiǎn)易貯存[J].黑龍江中醫(yī)藥，1994，3：52.

[3] 郝愛(ài)魚(yú)，趙麗元，劉英慧，等.HPLC柱后光衍生熒光法測(cè)定中藥飲片中黃曲霉毒素殘留量[J].藥物分析雜志，2012，32(12)：2203-2207.

[4] 謝昕，李紅艷.免疫親和柱凈化-光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜法測(cè)定柏子仁中的黃曲霉毒素[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2016，52(5)：541-544.

[5] 胡一晨，萬(wàn)麗，范成杰，等.免疫親和柱凈化HPLC柱后光化學(xué)衍生化法檢測(cè)中藥及染菌中藥制劑中間體的黃曲霉毒素[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(10)：116-119.

[6] 楊晶，欒國(guó)華，楊潤(rùn)陸.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定柏子仁中黃曲霉毒素殘留量[J].中國(guó)藥業(yè)，2011，20(14)：35-37.

[7] 栗建明，李純.中國(guó)藥典黃曲霉毒素檢測(cè)過(guò)程有關(guān)問(wèn)題分析[J].今日藥學(xué)，2016，26(6)：405-409.

[8] 鄭潤(rùn)生.中藥材污染真菌毒素的液質(zhì)聯(lián)用高通量檢測(cè)研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[9] Chen A J，Jiao X L，Hu Y J，et al.Mycotoxins in traditional medicinal seeds from China[J].Toxins，2015，7：3858-3875.

[10] Yang M H，Hen J M，Hang X H.Immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography with post-column derivatization for analysis of aflatoxins in traditional Chinese medicine[J].Omatographia，2005，62(9-10)：499-504.

[11] Villers P.Aflatoxins and safe storage[J].Front Microbiol，2014，5：1-6.

[12] Abrar M，Anjum F M，Butt M S，et al.Aflatoxins biosynthesis occurrence toxicity and remedies[J].Crit Rev Food Sci，2013，53(8)：862-874.

[13] 晉小軍，黃惠英，李國(guó)琴，等.不同包裝條件對(duì)黨參皂甙含量的影響[J].中國(guó)野生植物資源，2002，21(5)：57-59.

[14] 蔣桂華，賈敏如，馬逾英，等.川芎儲(chǔ)藏條件的研究[J].中藥材，2005，28(6)：464-466.

[15] 殷艷秀，韓英麗，韓燁.淺談枸杞子的采收加工和儲(chǔ)藏保管方法[J].黑龍江中醫(yī)藥，1998，2：49-50.

[16] 葉盛群，陳南南，諶剛.霉菌毒素吸附劑對(duì)牛奶中黃曲霉毒素M1含量的影響[J].飼料工業(yè)，2012，33(17)：17-18.

[17] 黃達(dá)明，林琳，林克龍.加熱對(duì)減少花生中黃曲霉毒素水平的作用[J].中國(guó)油脂，2006，31(7)：51-53.

[18] 胡蘭.飼料黃曲霉毒素的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè)，2001，22(3)：20-22.

[19] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：224-225.

[20] Passi S，Nazzaro-Porro M，F(xiàn)anelli C，et al.Role of lipoperoxidation in aflatoxin production[J].Appl Microbiol Biotechnol，1984，19(3)：186-190.

[21] Brodhagen M，Keller N P.Signaling pathways connecting mycotoxin production and sporulation[J].Mol Plant Pathol，2006，7(4)：285-301.

[22] Diener U L，Davis N D.Limiting temperature and relative humidity for growth and production of aflatoxin and free fatty acids byAspergillusflavusin sterile peanuts[J].J Am Oil Chem Soc，1967，44(4)：259-263.

[23] Northolt M D，Verhulsdonk C A H，Soentoro P S S，et al.Effect of water activity and temperature on aflatoxin production byAspergillusparasiticus[J].J Milk Food Technol，1976，39(3)：170-174.

[24] 劉光憲，祝水蘭，周巾英，等.CO2密閉貯藏對(duì)花生脂肪氧化及黃曲霉生長(zhǎng)的影響[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2017，38(6)：197-200.

[25] 徐新剛，付加雷，閆雪生.柏子仁和柏子仁霜中脂肪酸的GC-MS比較分析研究[J].齊魯藥事，2009，28(9)：523-524.

[26] Tiwari R P，Mittal V，Singh G，et al.Effect of fatty acids on aflatoxin production byAspergillusparasiticus[J].Folia Microbiol，1986，31(2)：120-123.

[27] Yan S J，Liang Y T，Zhang J D，et al.Autoxidated linolenic acid inhibits aflatoxin biosynthesis inAspergillusflavusvia oxylipin species[J].Fungal Genet Biol，2015，81：229-237.

[28] Burow G B，Nesbitt T C，Dunlap J，et al.Seed lipoxygenase products modulateAspergillusmycotoxin biosynthesis[J].Mol Plant Microbe In，1997，10(3)：380-387.

[29] 羅小榮，李人趙，付剛劍，等.蓮子中黃曲霉毒素去除方法研究[J].現(xiàn)代食品，2017，19：115-119.