吳衛(wèi)宇 ，蘇占元 ，楊曉軍 ，張宿義 ，秦 輝 ，趙金松 ，3，4

（1.國家酒類及加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心瀘州實驗室，四川瀘州646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000；4.四川理工學(xué)院，四川自貢643000）

白酒的主要成分是酒精和水，占總量的98%～99%，但決定白酒質(zhì)量和風(fēng)格的卻是微量（占總量的1%～2%）的呈香呈味有機化合物及其量比關(guān)系[1]。白酒中呈香呈味有機化合物主要包括多元醇、有機酸、酯類、高級醇、醛類、芳香族化合物及雜環(huán)類化合物[2-4]。據(jù)報道，江淮流域單糧型酒中重要風(fēng)味化合物有22種，從劍南春酒中檢測出重要風(fēng)味化合物21種，從五糧液酒中檢測出重要風(fēng)味化合物25種，這些重要風(fēng)味物質(zhì)相輔相成，使?jié)庀阈桶拙频摹跋?、味、格、體”協(xié)調(diào)統(tǒng)一[5]。

目前富集濃縮白酒中揮發(fā)性風(fēng)味成分的前處理方法有直接進樣、液液萃取、固相萃取、頂空固相微萃取及攪拌棒吸附萃取[6-9]等方法，用于分析檢測白酒中揮發(fā)性風(fēng)味成分的儀器主要有GC、GC-O、GC-MS及GC×GC-TOFMS[10-13]。

氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（GC/Q-TOFMS）是在飛行管和檢測器之前使用六級桿碰撞池執(zhí)行MS/MS，被色譜柱分離的樣品首先通過電子轟擊EI離子源進行電離，電離之后，離子將通過四級桿質(zhì)量分析器，質(zhì)量分析器包括4根平行雙曲面桿，通過這4根平行雙曲面桿，可以根據(jù)選定離子的質(zhì)荷比（m/z）來過濾這些離子。通過四級桿的離子隨后被引導(dǎo)至碰撞池，該碰撞池設(shè)置為選擇和碎裂前級離子以形成產(chǎn)物離子，這些離子通過切片器傳送，到達飛行管末端時，它們將從反射器或雙極離子鏡彈開，朝相反的路徑向下回到飛行管底部。模數(shù)檢測器位于飛行管的底部，它將計算離子的數(shù)量并將信號發(fā)送到特定軟件以進行數(shù)據(jù)收集和分析。故而，氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（GC/Q-TOFMS）具有高的分離能力、質(zhì)量準確度、掃描速度、靈敏度及4～5個數(shù)量級的動態(tài)范圍，可滿足白酒中痕量級揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測[14]。本實驗采用直接進樣結(jié)合氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（GC/Q-TOFMS）建立了一種測定白酒中79種主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的方法，該方法具有較高的準確度和靈敏度，能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒樣品。

儀器設(shè)備：7890B/7200Q-TOF氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技公司；超純水處理系統(tǒng)，美國密理博公司；電子天平（220 g,0.1 mg），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；移液槍（0～100 μL及100～1000 μL），大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司。

標準品（色譜純，純度≥99.9%）：甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、肉豆蔻酸乙酯、亞油酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、月桂酸、苯甲酸、苯丙酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、乙醛、正丙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、己醛、糠醛、苯甲醛、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、甲醇、2-丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、己醇、庚醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、吡啶、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、2-甲基苯酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對甲酚、3-甲基苯酚、4-乙基苯酚：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

內(nèi)標物（色譜純，純度≥99.9%）：叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸，天津市津科精細化工研究所。

水：符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水，本實驗室自制。

溶劑：無水乙醇（色譜純）及加水配制為60%vol的乙醇溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 GC-MS條件

色譜柱：VF-WAXms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純He（99.999%）；流速1 mL/min；進樣模式：分流進樣，分流比 20∶1；進樣量：1 μL；載氣：20.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度35℃保持10 min，以2℃/min升溫至120℃，再以5℃/min升溫至200℃，再以10℃/min升溫至245℃，保持40 min；GC/Q-TOFMS接口溫度：280℃；EI離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃，四級桿溫度：150℃；質(zhì)量掃描范圍m/z：29～500。

1.2.2 內(nèi)標溶液的制備

準確稱量叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸置于200 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標溶液，3種內(nèi)標的濃度分別為15.19 g/L、15.10 g/L、15.09 g/L。

1.2.3 標準溶液的制備

混標1#：準確稱取甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、異丁酸乙酯、戊酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為78.1 mg/L、1612.5 mg/L、70.1mg/L、878mg/L、614mg/L、80.9mg/L、1136.5mg/L、64.8 mg/L、711 mg/L、608 mg/L、4610 mg/L、710 mg/L、2427.5 mg/L、639 mg/L、715 mg/L、79.3 mg/L。

混標2#：準確稱取月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯置于50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為88.4 mg/L、612 mg/L、310 mg/L、75.2 mg/L、736 mg/L。

混標3#：準確稱取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為2272 mg/L、432 mg/L、589 mg/L、597 mg/L、930 mg/L、579 mg/L、1443 mg/L、686 mg/L、658 mg/L、623 mg/L。

混標4#：準確稱取月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、苯甲酸、苯丙酸、亞油酸置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為286 mg/L、134 mg/L、365 mg/L、184 mg/L、189 mg/L、137 mg/L、64.3 mg/L、376 mg/L。

混標5#：準確稱取乙醛、正丙醛、異丁醛、異戊醛、己醛、糠醛、苯甲醛、乙縮醛置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為761 mg/L、313 mg/L、78.2 mg/L、385 mg/L、378 mg/L、761 mg/L、260 mg/L、1069 mg/L。

混標6#：準確稱取2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為426 mg/L、53.8mg/L、438 mg/L、280 mg/L、129 mg/L。

混標7#：準確稱取甲醇、正丙醇、2-丁醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、糠醇、β-苯乙醇置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為860 mg/L、997 mg/L、283 mg/L、334 mg/L、292 mg/L、412 mg/L、308 mg/L、309 mg/L、285 mg/L、332 mg/L、347 mg/L、298 mg/L、416 mg/L。

混標8#：準確稱取2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、吡啶置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為232 mg/L、314 mg/L、298 mg/L、302 mg/L、399 mg/L、82 mg/L、387 mg/L。

混標9#：準確稱取苯酚、3-甲基苯酚、2-甲基苯酚、4-乙基苯酚、對甲酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為141.2 mg/L、379 mg/L、404mg/L、110.7mg/L、584mg/L、500mg/L、419mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

液液萃取方法操作簡單、回收率高，但有機溶劑用量大，萃取濃縮過程中也會損失一部分易揮發(fā)性成分[15]。固相微萃取技術(shù)是在固相萃取技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品萃取技術(shù)，該技術(shù)與固相萃取技術(shù)相比操作更簡單、攜帶更方便并且克服了固相萃取回收率低、易堵塞孔道的缺點，但該技術(shù)需要配套的固相微萃取操作平臺及萃取頭，價格昂貴，不利于大批量處理樣品[16]。攪拌棒吸附萃取技術(shù)是一種新型的固相微萃取樣品前處理技術(shù)，具有固定相體積大、萃取容量高、無需外加攪拌子、可避免競爭性吸附、能在自身攪拌的同時實現(xiàn)萃取富集等優(yōu)點，但同樣具有價格昂貴不利于大批量處理樣品的缺點[15]。本實驗是針對大批量用于指導(dǎo)釀酒生產(chǎn)、酒體設(shè)計等工作的樣品，故而選擇直接進樣法，該方法操作簡單，無需有機溶劑，避免樣品處理中微量成分的損失，具有簡單快速、重現(xiàn)性好、檢測準確度高并且成本消耗低等優(yōu)點。

2.2 色譜柱的選擇[10]

白酒色譜分析所用的毛細管柱通常都是極性柱，常見的有 DB-WAX、HP-INNOWAX、HPFFAP、DB-WAXFF及近幾年剛剛上市的VFWAXms柱。本實驗通過測試發(fā)現(xiàn)HP-FFAP柱無法將乙酸乙酯及乙縮醛分離開；HP-INNOWAX柱乙酸乙酯和乙縮醛、丁酸乙酯和正丙醇分離度不好；DB-WAX柱基本能把白酒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分分離開，但是酸類成分的峰形不佳；VF-WAXms柱能把白酒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分分離，并且峰形尖銳便于準確定量，故本實驗優(yōu)選色譜柱VF-WAXms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）測定白酒中79種揮發(fā)性風(fēng)味成分。

2.3 進樣量和分流比的選擇

進樣量過大，容易造成柱子過載損害柱子的固定相液膜；進樣量過小，使檢測器響應(yīng)信號降低不易檢測出揮發(fā)性風(fēng)味成分。因此，進樣量和分流比對于組分的分離、儀器的響應(yīng)有很大影響，進而影響定量的準確性[17]。本實驗通過測試發(fā)現(xiàn)，當選用進樣量1 μL、分流比20∶1時，79種組分得到了較好的分離，檢測器響應(yīng)較好，定量各種物質(zhì)的線性關(guān)系較好。

2.4 升溫程序的選擇

對于含有多種微量成分的白酒樣品，常常需要用程序升溫分離，因為在恒溫條件下，如果柱溫較低，則低沸點組分分離較好，而高沸點組分的流出時間會太長，造成峰展寬，甚至滯留在色譜柱中造成柱污染；反之，當柱溫太高時，低沸點組分又難以分離[18]。故而，本實驗采用程序升溫并且是多階程序升溫，升溫速率較慢，可以較好的分離79種揮發(fā)性風(fēng)味成分。

2.5 質(zhì)譜定性定量

分別取混標1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9# 稀釋液加內(nèi)標，按照1.2.1條件進行全掃描，得到混標1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#的總離子流色譜圖分別見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9。并利用NIST2012標準圖譜庫進行檢索，確定每種物質(zhì)的保留時間和特征離子碎片，選擇豐度相對較高的離子作為定性離子，把豐度較高并且與相鄰峰之間無干擾的離子作為定量離子，質(zhì)譜條件見表1。在相同條件下進行標樣測定，采用峰面積比與質(zhì)量濃度比的內(nèi)標法結(jié)合標準曲線法定量分析。

2.6 方法線性范圍

分別取混標 1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，用體積分數(shù)為60%的乙醇溶液稀釋成5個梯度混合標樣，分別移取5 mL到比色管中，并加入0.1 mL的內(nèi)標溶液，搖勻，上機測定。以混標中各組分對應(yīng)內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，以混標中各組分與對應(yīng)內(nèi)標含量比值為橫坐標，計算得到79種物質(zhì)的回歸線性方程和相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，79種成分在上述條件下分析檢測時，在各自濃度范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測。

圖1 混標1#總離子流色譜圖

圖2 混標2#總離子流色譜圖

圖3 混標3#總離子流色譜圖

圖4 混標4#總離子流色譜圖

圖5 混標5#總離子流色譜圖

圖6 混標6#總離子流色譜圖

圖7 混標7#總離子流色譜圖

圖8 混標8#總離子流色譜圖

圖9 混標9#總離子流色譜圖

2.7 方法檢出限、精密度和回收率

檢出限和定量限主要是考察方法的靈敏度；而回收率主要是考察所建方法的準確度。本實驗利用無水乙醇和水配制成不含這79種揮發(fā)性風(fēng)味成分的60%vol白酒代用樣，量取5 mL，分別添加3個濃度梯度D1（5 mL標準儲備液）、D2（10 mL標準儲備液）、D3（15 mL標準儲備液），用60%vol的無水乙醇定容至25 mL，分別移取5 mL到比色管中，并加入0.1 mL的內(nèi)標溶液，搖勻，每個濃度水平平行測試6次。利用上述水平進行添加回收率試驗，平均回收率和相對標準偏差（RSD，n=6）結(jié)果見表3。并利用添加D1（5 mL標準儲備液）的濃度水平為依據(jù)，3倍信噪比計算檢出限，10信噪比計算定量限，計算結(jié)果見表3。

由表3可知，各成分平均回收率為95.67%～106.32%，RSD為1.20%～4.21%，方法檢出限為0.027～1.69 mg/L，定量限為0.081～5.07 mg/L。能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測，用于指導(dǎo)酒廠生產(chǎn)實踐及酒體設(shè)計工作。

3 結(jié)論

采用直接進樣技術(shù)結(jié)合氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（GC/Q-TOFMS）建立了一種測定白酒中79種主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的方法。在選定的色譜條件下，79種物質(zhì)得到了較好的分離，在各自濃度范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，方法回收率在95.67%～106.32%，方法檢出限和定量限分別為0.027～1.69 mg/L和0.081～5.07 mg/L。該方法具有較高的準確度和靈敏度，能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定。

表1 79種揮發(fā)性風(fēng)味成分保留時間、定性和定量離子

續(xù)表1 79種揮發(fā)性風(fēng)味成分保留時間、定性和定量離子

表2 79種揮發(fā)性風(fēng)味成分工作標準曲線

續(xù)表2 79種揮發(fā)性風(fēng)味成分工作標準曲線

續(xù)表3 79種揮發(fā)性風(fēng)味成分方法檢出限、精密度和回收率(n=6)

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