尚冰清

（徐州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系院 江蘇 徐州 221006）

基因的表達(dá)調(diào)控，涉及到多個因素的互相作用，是一個較為復(fù)雜的過程。在基因治療中，如果對目的基因的表達(dá)時間和表達(dá)水平能進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，就能夠有效的降低其副作用的發(fā)生率，提高治療效果，為基因治療提供重要的理論基礎(chǔ)。一般來說，一個理想的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有以下特點：特異性、非干擾性、可誘導(dǎo)性、可逆性、劑量依賴性。目前，較為成熟的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)有四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，RU486誘導(dǎo)系統(tǒng)。其中四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，本文簡要回顧了其發(fā)展過程和應(yīng)用研究。

1.四環(huán)素調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)的分子學(xué)機(jī)制

1.1 Tet調(diào)控系統(tǒng)

1992年，Gossen等最早建立了Tet-off基因調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)是在大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10中，以Tet阻遏因子(TetR)負(fù)性調(diào)控四環(huán)素操縱子為基礎(chǔ)而建立的。含有調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒兩部分(如圖1.A)。調(diào)節(jié)質(zhì)粒是一個四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(tTA)，由單純皰疹病毒(HSV)VP16蛋白中含有127個氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)與含有207個氨基酸的四環(huán)素阻遏蛋白(TetR)融合而成。反應(yīng)質(zhì)粒包含目的基因和四環(huán)素反應(yīng)元件(Ptet)。Ptet包含7個正向排列的Tet0 序列，含有TATA盒的多克隆位點在其下游，是巨細(xì)胞病毒的最小啟動子(minimal CMV promoter，PminCMV)。因為該啟動子缺乏增加子，無四環(huán)素(Tc)或者強力霉素(dox)不存在的情況下，tTA與Ptet特異性結(jié)合，目的基因得以表達(dá)。而Tc或dox可特異性結(jié)合tTA，分離tTA與Ptet，阻止下游轉(zhuǎn)錄。

圖1.四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)

在1995年，Gossen等在tTA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了它的反向突變體rtTA，建立了Tet-on調(diào)控系統(tǒng)(如圖1.B)。rtTA與tTA有4個氨基酸發(fā)生了突變，與當(dāng)有Tc存在時，rtTA才能與Ptet特異性結(jié)合，啟動下游基因的表達(dá)。由于活體組織攝取Tc要比清楚快的多，因此在基因轉(zhuǎn)錄方面，Tet-on調(diào)控系統(tǒng)要比Tetoff調(diào)控系統(tǒng)迅速的多。

1.2 Tet調(diào)控系統(tǒng)的優(yōu)點

Tet調(diào)控系統(tǒng)特異性強，且具有較高的誘導(dǎo)效率。特異性的原因尚不明確，猜測是由于四環(huán)素反應(yīng)元件來自原核生物，而原核調(diào)節(jié)蛋白的DNA靶序在真核細(xì)胞中是不存在，故其靶序作用很特異。且不影響真核基因組表達(dá)。Tet系統(tǒng)在無誘導(dǎo)時，目的基因表達(dá)量低甚至無表達(dá)，四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)具有低背景表達(dá)和高水平誘導(dǎo)兩大特點。此外，相比較于其他系統(tǒng)的誘導(dǎo)因子如激素、熱休克，四環(huán)素作為抗生素，對細(xì)胞的毒害性較小。

Tet-off/Tet-on系統(tǒng)能夠有效的控制目的基因表達(dá)，尤其是Tet-on系統(tǒng)。但該系統(tǒng)仍不夠完善:rtTA的穩(wěn)定性不能令人滿意，在一些細(xì)胞內(nèi)容易降解；更為重要的是基因泄露問題:在非誘導(dǎo)情況下，rtTA與tetO仍具有一定的結(jié)合率，誘導(dǎo)基因表達(dá)，致使目的基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平較高。

2.Tet調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)用

隨著不斷研究和改進(jìn)，四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的體外培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因小鼠以及其他動物的誘導(dǎo)性基因表達(dá)研究中。誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)可以在時間上調(diào)控基因的表達(dá)，作為基因功能研究重要工具之一。其中的四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)，是應(yīng)用最廣泛的一種。在此基礎(chǔ)上相繼建立了雙向啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)、與四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄沉默系統(tǒng)（tTS）以及Cre/loxP系統(tǒng)結(jié)合的誘導(dǎo)性條件性基因敲除系統(tǒng)，它們在研究哺乳動物基因的功能及表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用[1-2]。

其中，它在基因治療方面的研究得到了廣泛的關(guān)注。

通過tet調(diào)控系統(tǒng)來調(diào)節(jié)GDNF表達(dá)來治療帕金森氏病，該系統(tǒng)將會適時決定關(guān)閉基因表達(dá)或調(diào)控基因表達(dá)來阻止由于細(xì)胞異常增殖帶來的不良副作用，如細(xì)胞連接錯誤，或釋放出的異常神經(jīng)遞質(zhì)。2009年，Manfredsson等成功驗證了rAAV-TetOff載體在大鼠腦中的有效調(diào)控。相對于病毒載體來說，tet調(diào)控系統(tǒng)僅需較小的誘導(dǎo)劑量，當(dāng)dox濃度為0.3μg/ml時，GDNF的表達(dá)完全消失[3]。然而有研究[4]表明，由于血腦屏障的存在，需要維持較高的血漿 dox濃度而相對較低腦脊液（CSF）來誘導(dǎo)大腦中rtTA2S-M2驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。應(yīng)該避免長期高劑量的dox的毒副作用，因此，在較低dox水平下更活躍的新rtTA變體是可取的。

有研究[5]表明，通過構(gòu)建的以DNA載體介導(dǎo)的能夠高效調(diào)控siRNA沉默基因效應(yīng)的Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)，能夠促進(jìn)其在更多模型系統(tǒng)中進(jìn)行基因功能研究的應(yīng)用。通過構(gòu)建DNA載體介導(dǎo)的小干擾RNA(siRNA)Tet-on表達(dá)載體，pDIRS4.1 siRNA。隨著Dox濃度升高，pDIRS4.1 siRNA載體在人成骨肉瘤細(xì)胞中對目的基因的沉默作用有較好的調(diào)控性，且目的基因的表達(dá)與Dox具有嚴(yán)格的劑量依賴關(guān)系，高濃度Dox時，IL-6表達(dá)水平降低約12倍。

此外，有研究[6]表明，通過構(gòu)建攜帶四環(huán)素真核誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Tet-on)調(diào)控的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(hBMP-2)慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，可為骨缺損修復(fù)提供可控的成骨活性細(xì)胞。構(gòu)建攜帶可調(diào)控系統(tǒng)的感染293T細(xì)胞后獲得hBMP-2-GV347慢病毒濃縮液，在DOX誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)染后的BMSC細(xì)胞增殖能力較普通BMSC強，并在DOX濃度為10μg/ml誘導(dǎo)下穩(wěn)定表達(dá)BMP-2蛋白和RNA。

Tet生物功能和催化機(jī)制的研究將有助于深入了解與DNA去甲基化途徑相關(guān)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，同時也為研發(fā)全新的抗腫瘤靶向藥物提供參考。

基因治療的目的：是為當(dāng)前尚無完善的治療方案的疾病提供更為合適的治療方法。目前，國際上已在臨床上試行的基因治療超過300例，包括惡性腫瘤、神經(jīng)性疾病、心血管疾病、感染性疾病和眼病等。迄今為止，已經(jīng)利用腺病毒載體或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在I、Ⅱ和Ⅲ期臨床實驗中來治療惡性膠質(zhì)瘤。

四環(huán)素基因調(diào)控系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的調(diào)控系統(tǒng)，已被用于多種載體中，已經(jīng)被編碼在慢病毒屬、腺病毒屬、腺相關(guān)病毒屬和逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，而且可以有效地對基因進(jìn)行調(diào)控，這增加了Tet系統(tǒng)在不同器官中應(yīng)用的可能性。為增強其安全性，還需繼續(xù)對調(diào)控的嚴(yán)密性和特異性進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展。

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