魏書山 王豐 林元相 康德智 黃小芬 余良宏 林章雅 張聰

腦外傷是獲得性癲癇最主要的發(fā)病原因之一。外傷性癲癇（post-traumatic epilepsy，PTE）約占獲得性癲癇的5%，多轉(zhuǎn)歸為難治性癲癇，常常導(dǎo)致嚴(yán)重的生理和心理障礙[1,2]。然而，PTE的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。由谷氨酸和γ-氨基丁酸 （γ-amino butyric acid，GABA）介導(dǎo)的興奮性-抑制性遞質(zhì)紊亂被認(rèn)為是癲癇形成最重要的原因[3]。許多研究表明，受GABA調(diào)控的 NA+-K+-2CL-轉(zhuǎn)運(yùn)體（NA+-K+-2CL-co-transporter，NKCC1）和 K+-CL-轉(zhuǎn)運(yùn)體（K+-CL-co-transporter，KCC2）參與癲癇的發(fā)生[4]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的異常激活在癲癇形成中的作用近年來成為研究熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)表明，mTOR通路激活后可調(diào)節(jié)NKCC1、KCC2的功能狀態(tài)，從而導(dǎo)致癲癇發(fā)作[5]。在PTE中，mTOR通路和NKCC1、KCC2是否參與癲癇形成以及其致癇機(jī)制如何，目前鮮有研究。本研究旨在通過Western blot和實(shí)時定量熒光PCR （real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)了解NKCC1、KCC2及mTOR下游信號因子4E-BP1在致癇灶中的表達(dá)情況，探討其可能的發(fā)病機(jī)制，為防治PTE的發(fā)生尋求新的途徑。

材料與方法

一、標(biāo)本制作

選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科自2010年1月至2015年12月收治并行外科手術(shù)治療的PTE患者14例作為PTE組，外傷前均無癲癇發(fā)作病史或家族史。其中男性9例，女性5例；年齡11～39歲，中位年齡21歲；癲癇發(fā)作病程0.5～15年，中位值73個月；癲癇發(fā)作類型：單純部分性發(fā)作1例、復(fù)雜部分性發(fā)作10例、繼發(fā)全面性發(fā)作3例，癲癇發(fā)作于傷后0.5～17年出現(xiàn)。10例患者因額頂部挫裂傷伴血腫行開顱血腫清除、去骨瓣減壓術(shù)，其中1例患者仍有顱骨缺損；4例患者因額顳枕部挫裂傷行保守治療。所有患者同時口服2種及以上抗癲癇藥物，均在血藥濃度范圍內(nèi)，每個月仍有3次以上發(fā)作。術(shù)中采用24導(dǎo)或32導(dǎo)顱內(nèi)柵狀皮質(zhì)電極在腦皮質(zhì)進(jìn)行地毯式的腦電圖探測，重復(fù)探測2～3次，同時記錄部位以及腦電圖變化情況，根據(jù)結(jié)果對癲癇病灶進(jìn)行最大限度切除，筆者選取切下的癲癇病灶作為PTE組標(biāo)本，共14組（經(jīng)過福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理專家委員會批準(zhǔn)）。

選取本院同期收治并行外科手術(shù)治療的腦外傷患者8例為對照組，均為顱腦外傷后不可避免要手術(shù)切除的正常腦組織樣本（經(jīng)過醫(yī)院倫理專家委員會批準(zhǔn)），因?yàn)橥鈧罂赡艿募毙院蛥^(qū)域性炎癥反應(yīng)發(fā)生在直接損傷部位[3]。其中男性3例，女性5例；年齡19～54歲，中位年齡36歲；外傷前均無癲癇發(fā)作病史或家族史。筆者選擇這些腦組織遠(yuǎn)離直接損傷部位并為顱腦外傷后6 h內(nèi)的標(biāo)本；這些患者之前無驚厥史和其他神經(jīng)病史，并且經(jīng)2位病理科專家確定無神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)異常及其他明顯病變。

二、試劑耗材

4E-BP1（鼠抗人多克隆抗體，Santa Cruz，美國，1∶100）；NKCC1（兔抗人多克隆抗體，Santa Cruz，美國，1∶100）；KCC2（兔抗人單克隆抗體，Santa Cruz，美國，1∶200）；β-Actin（內(nèi)參蛋白抗體，Santa Cruz，美國，1∶5000）；NEP019-2（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，100 μL）；M-MLV、TRT-101（TOYOBO，日本，100μL）；RQ1RNase-freeDNase、M6101（Promega，美國，1000 U）；dNTPs，GD1102-1ML（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，1 mL）；TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，200 μL）；Ultra SYBR 試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰?，50 μL）；所有隨機(jī)引物，RIP022（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，200 μL）。

三、Western blot

用滅菌的預(yù)冷的剪刀分離目的組織，置于冰上以防止蛋白酶的水解；稱量保存于-80℃冰箱的組織50～100 mg放在玻璃勻漿器中，加入500～1000 μL RIPA裂解液，裂解液中加入苯甲基磺酰氟（1 mmol/L），在冰上進(jìn)行勻漿，直至勻漿充分無塊狀；超聲粉碎：將勻漿液吸入離心管中，將超聲探頭沒入混懸液內(nèi)，粉碎2 min，分4次，每次30 s，功率為100～200 W，避免起氣泡，粉碎時，樣品置于冰上；4℃離心12 000 r/min，10 min；輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中至于冰上，即為提取的蛋白，棄沉淀。用BCA法蛋白定量，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?0%分離膠和5%濃縮膠。樣品取相同總蛋白含量 （50～100 μg），加入相同體積的5×loading buffer上樣緩沖液；混勻后，沸水浴煮10 min。用微量加樣器進(jìn)行加樣，樣品加樣完畢后，如有剩余的孔，應(yīng)加上等體積的1×loading buffer上樣緩沖液。恒壓80 V預(yù)電泳10 min至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)分離膠，將電壓調(diào)整到恒壓120 V，電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。濕法轉(zhuǎn)膜，按照電流1.2 mA/cm2膜面積，恒流轉(zhuǎn)膜；0.45 μm孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間2 h。封閉：將膜浸沒在Western blot封閉液Ⅱ（TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH 7.4）中37℃輕搖1 h，一抗孵育（一抗分別為 β-actin、4E-BP1、NKCC1、KCC2）：用5%的脫脂奶粉稀釋一抗，每張膜約4 mL，室溫下?lián)u床緩慢搖蕩孵育3 h；洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min。二抗孵育：用5%的脫脂奶粉按二抗說明書比例稀釋二抗 （通常1∶4000～1∶20 000），37℃輕搖 2 h；洗膜：TBST洗膜5次，每次10 min。ECL反應(yīng)、膠片曝光：1張8 cm×6 cm大小的膜用1 mL ECL反應(yīng)3 min，曝光1 min（曝光時間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整），顯影5 min，定影5 min。底片通過凝膠灰度分析軟件Quantity One 4.6.2進(jìn)行灰度值定量。

四、RT-PCR

（一）引物的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank獲得目的基因mRNA的全長序列，利用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列。經(jīng)過Blast分析，引物序列具有特異性。RT-PCR檢測所用的引物及內(nèi)參照β-actin引物序列見表1。

表1 RT-PCR檢測所用的引物及內(nèi)參照β-actin引物序列

（二）實(shí)驗(yàn)過程

1.提取樣本RNA：（1）將樣本用液氮研磨后，加入1.5 mL無RNase EP管中，并加入1 mL Trigol后，劇烈震蕩混勻，室溫放置5 min，使其充分裂解，12 000 r/min離心5 min，吸上清轉(zhuǎn)入無RNase的1.5 mL EP管中。（2）向EP管中加入200 μL氯仿，蓋緊管蓋，用漩渦震蕩儀震蕩混勻15 s，4℃靜置5 min。12 000 r/min，離心 15 min，樣品分為3層：無色水相、中間層和有機(jī)相。將無色水相移至新的EP管中備用。（3）再按等體積加入異丙醇，上下顛倒充分混勻，-20℃靜置 30 min。4℃，12 000 r/min，離心 10 min，棄上清，RNA沉于管底。（4）加入1 mL 75%乙醇 （無RNase水配置），溫和振蕩EP管，懸浮沉淀。 4℃，8 000 r/min，離心 5 min，盡量棄上清。注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出。（5）室溫晾干或真空干燥5～10 min。最后將獲得的總RNA溶于30 μL無RNase水中備用。

2.RNA完整性的測定：取5 μL RNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。RNA電泳28SrRNA、18SrRNA條帶清晰可見，說明RNA未降解。

3.反轉(zhuǎn)錄：以已經(jīng)提取的用DNase處理的總RNA為模板，使用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。取0.2 mL DEPC處理的PCR管，在PCR管中配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，步驟在冰浴中進(jìn)行。加完各種試劑后，輕輕混勻，然后稍微離心使反應(yīng)液聚集在PCR管底部。然后放到PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物貯于-20℃?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。

4.RT-PCR：（1）采用 PRISM 7500熒光定量 PCR儀（ABI，美國），△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。（2）PCR反應(yīng)體系，用Ultra SYBR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?94℃ 2 min（94℃ 30 s，72℃ 30 s）×35 個循環(huán)。所有RT-PCR的擴(kuò)增體系都是一樣的。2×Mix包括 Taq 酶，Taq buffer，dNTPs。

5.溶解曲線制備：在7500熒光定量PCR儀上選定溶解曲線程序。在爬坡過程中連續(xù)收集樣品的熒光信號以獲取熔解曲線，熔解曲線通過定量PCR儀自帶的分析軟件獲取，程序結(jié)束后進(jìn)行分析。詳細(xì)信息見圖1。

6.擴(kuò)增曲線制備：在7500熒光定量PCR儀上選定溶解曲線程序。在爬坡過程中連續(xù)收集樣品的熒光信號以獲取擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線通過定量PCR儀自帶的分析軟件獲取，程序結(jié)束后進(jìn)行分析。詳細(xì)信息見圖2。

（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）RNA電泳圖，取5 mL RNA，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。（2）根據(jù)繪制的曲線，各樣品RT-PCR檢測結(jié)果，4E-BP1、NKCC1和 KCC2 mRNA相對定量分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western blot相對灰度值和RT-PCR目的基因mRNA相對定量CT比值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行圖像分析；采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)數(shù)據(jù)特征獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)合方差齊性分析得出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 基因溶解曲線圖

圖2 基因擴(kuò)增曲線圖

結(jié) 果

一、Western blot

從Wertern blot結(jié)果可以看出，PTE組中 4EBP1、NKCC1 灰度值（0.61±0.12、0.92±0.19）高于對照組（0.27±0.05、0.67±0.66），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045，0.027）；PTE 組中 KCC2 灰度值（0.58±0.99）低于對照組（0.72±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.047）。PTE 組中 NKCC1/KCC2 比值（1.59±0.31）高于對照組（0.93±0.46），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。 詳細(xì)信息見圖3～4、表2。

圖 3 Wertern blot檢測 β-actin、4E-BP1、NKCC1、KCC2的表達(dá)

圖4 PTE組和對照組NKCC1/KCC2比值圖

表 2 內(nèi)參蛋白 β-actin、4E-BP1、NKCC1和KCC2相對灰度值對比

二、RT-PCR

從RT-PCR結(jié)果可以看出，PTE組中4E-BP1、NKCC1 灰度值（30.84±1.32、27.81±1.92），高于對照組（26.94±1.24、23.52±0.74），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046，0.023）；PTE 組中 KCC2 灰度值 （21.55±1.01）低于對照組（24.59±1.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048）。 PTE 組中 NKCC1/KCC2 比值（1.29±0.11）高于對照組（0.96±0.26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）。詳細(xì)信息見圖5～6、表3。

圖 5 RT-PCR 檢測目的基因 β-actin、4E-BP1、NKCC1、KCC2表達(dá)灰度值

圖6 PTE組和對照組NKCC1/KCC2比值

表3 PTE組和對照組4E-BP1相對灰度值

討 論

腦外傷后常導(dǎo)致長期神經(jīng)回路的改變，引起癲癇樣改變，甚至導(dǎo)致PTE。許多研究表明，PTE的形成與抑制性GABA神經(jīng)遞質(zhì)有不可分割的關(guān)系[6]。越來越多的證據(jù)表明哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）異常激活與癲癇發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在TBI患者及CCI動物模型中均發(fā)現(xiàn)有mTORC1磷酸化激活[7]。文獻(xiàn)表明，在膠質(zhì)瘤合并癲癇中，NKKC1、KCC2的異常表達(dá)和局部區(qū)域mTOR信號通路的異常激活有關(guān)[8]。筆者課題組也在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在FCDIIA合并癲癇病灶中，存在mTOR信號通路的異常激活，且神經(jīng)元中NKCC1/KCC2比值失調(diào)；說明mTOR可以通過某些機(jī)制參與對NKCC1、KCC2表達(dá)的調(diào)節(jié)。

GABA是人體內(nèi)最為重要的抑制性神經(jīng)遞，其作用通過3個受體而產(chǎn)生，分別為GABA-A、GABAB和GABA-C，其中以GABA-A受體最為重要[9]。人體發(fā)育的早期，GABA扮演著興奮性作用，在神經(jīng)細(xì)胞增生、遷移、分化、神經(jīng)回路的形成等各方面起至關(guān)重要的作用。而在成熟神經(jīng)元中，GABA則扮演著抑制性作用[10]。GABA發(fā)揮抑制性作用的前提是維持細(xì)胞內(nèi)低氯，這主要受CCCs家族調(diào)節(jié)[11]。而調(diào)節(jié)體內(nèi)Cl-穩(wěn)態(tài)的NKCC1、KCC2正是介導(dǎo)GABA功能轉(zhuǎn)變最重要的離子通道。NKCC1蛋白主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中，KCC2主要存在于神經(jīng)元中，因此神經(jīng)元胞內(nèi)的Cl-濃度主要由NKCC1和KCC2來共同調(diào)節(jié)的[12]。NKCC1蛋白可將將 Na+、K+、Cl-按 1∶1∶2 的比例跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入神經(jīng)元胞體。KCC2可將K+和Cl-按1∶1的比例呈電中性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)出神經(jīng)元胞體[13,14]。因此，NKCC1的主要作用為保持細(xì)胞內(nèi)較高的Cl-濃度，而KCC2主要維持神經(jīng)元胞內(nèi)較低的Cl-濃度。NKCC1和KCC2的差異性表達(dá)決定了神經(jīng)元內(nèi)Cl-的濃度，從而決定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GABA介導(dǎo)興奮性還是抑制性效應(yīng)[8]。Wang等[15]指出，TBI后 NKCC1 升高，KCC2 降低，通過NKCC1抑制劑布美他尼可降低PTE的發(fā)生率[15]。Schwarzbach等[16]和Wu等[17]發(fā)現(xiàn)大鼠在TBI后KCC2降低和功能缺失導(dǎo)致GABA介導(dǎo)的抑制性和修復(fù)功能缺失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組正常腦組織相比，實(shí)驗(yàn)組中NKCC1含量增加，KCC2含量降低，NKCC1/KCC2的比值增大。由此推測或許是因?yàn)镹KCC1與KCC2的差異性表達(dá)，NKCC1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將更多的Cl-轉(zhuǎn)入神經(jīng)元內(nèi)，使GABA介導(dǎo)興奮性效應(yīng)，引起大腦神經(jīng)元異常放電而引發(fā)癲癇。

目前研究認(rèn)為，mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR信號通路參與了癲癇多種分子水平、細(xì)胞水平的病理改變[18]。其中與PTE的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系的是mTORC1介導(dǎo)的信號通路?；罨膍TORC1通過磷酸化下游多種效應(yīng)分子，如S6K、4E-BP1，產(chǎn)生多重病理生理改變從而參與癲癇的發(fā)生發(fā)展，而通過抑制mTORC1則具有抗癲癇發(fā)生的作用[19]。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中4E-BP1的含量明顯較對照組升高，說明在PTE中存在mTOR信號通路的激活。在前期研究中，通過動物實(shí)驗(yàn)證明在Fecl2介導(dǎo)的大鼠PTE模型中mTOR、p70s6k升高，說明在PTE中存在mTOR信號通路的激活。本次實(shí)驗(yàn)中通過Western blot、RT-PCR技術(shù)，觀察到在PTE組中癲癇灶周圍皮質(zhì)4E-BP1表達(dá)增高，說明致癇灶中有mTOR信號通路的激活；還觀察到與正常腦組織相比，PTE組中還存在NKCC1/KCC2比值增高。筆者推測在PTE中，mTOR通路激活后，通過下游因子4E-BP1調(diào)節(jié)NKCC1、KCC2的表達(dá)。但是mTOR信號通路是如何參與NKCC1、KCC2的表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，尚需要神經(jīng)電生理及動物實(shí)驗(yàn)研究才能證實(shí)。

[1] Darrah SD,Miller MA,Ren D,et al.Genetic variability in glutamic acid decarboxylasegenes:associationswith posttraumatic seizures after severe TBI[J].Epilepsy Res,2013,103(2-3):180-194.

[2] Rao VR,Parko KL.Clinical approach to posttraumatic epilepsy[J].Semin Neurol,2015,35(1):57-63.

[3] Irimia A,Van Horn JD.Epileptogenic focus localization in treatment-resistant post-traumatic epilepsy[J].J Clin Neurosci,2015,22(4):627-631.

[4] Talos DM,Sun H,Kosaras B,et al.Altered inhibition in tuberous sclerosis and type IIb cortical dysplasia[J].Ann Neurol,2012,71(4):539-551.

[5] Kim JY,Liu CY,Zhang F,et al.Interplay between DISC1 and GABA signaling regulates neurogenesis in mice and risk for schizophrenia[J].Cell,2012,148(5):1051-1064.

[6] Hunt RF,Boychuk JA,Smith BN.Neural circuit mechanisms of post-traumatic epilepsy[J].Front Cell Neurosci,2013,7:89.

[7] Berdichevsky Y,Dryer AM,Saponjian Y,et al.PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampalculturemodelofpost-traumaticepilepsy[J].J Neurosci,2013,33(21):9056-9067.

[8] Orlova KA,Tsai V,Baybis M,et al.Early progenitor cell marker expression distinguishes type II from type I focal cortical dysplasias[J].J Neuropathol Exp Neurol,2010,69(8):850-863.[9] Wu C,Sun D.GABA receptors in brain development,function,and injury[J].Metab Brain Dis,2015,30(2):367-379.

[10] Rice A,Rafiq A,Shapiro SM,et al.Long-lasting reduction of inhibitory function and GABA A subunit mRNA expression in a model of temporal lobe epilepsy[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(18):9665-9669.

[11] Lakhani R,Vogel K R,Till A,et al.Defects in GABA metabolism affect selective autophagy pathways and are alleviated by mTOR inhibition[J].EMBO Mol Med,2014,6(4):551-566.

[12] Kalkman HO.Alterations in the expression of neuronal chloride transporters may contribute to schizophrenia[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2011,35(2):410-414

[13] Hyde TM,Lipska BK,Ali T,et al.Expression of GABA signaling molecules KCC2,NKCC1,and GAD1 in cortical development and schizophrenia[J].J Neurosci,2011,31(30):11088-11095.

[14] Loscher W,Puskarjov M,Kaila K.Cation-chloride cotransporters NKCC1 and KCC2 as potential targets for novel antiepileptic and antiepileptogenic treatments[J].Neuropharmacology,2013,69:62-74.

[15] Wang F,Wang X,Shapiro LA,et al.NKCC1 up-regulation contributes to early post-traumatic seizures and increased posttraumatic seizure susceptibility[J].Brain Struct Funct,2016,222(3):1543-1556.

[16] Schwarzbach E,Bonislawski DP,Xiong G,et al.Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury[J].Hippocampus,2006,16(6):541-550.

[17] Wu H,Shao A,Zhao M,et al.Melatonin attenuates neuronal apoptosis through up-regulation of K(+)-Cl(-)cotransporter KCC2 expression following traumatic brain injury in rats[J].J Pineal Res,2016,61(2):241-250.

[18] Butler CR,Boychuk JA,Smith BN.Differential effects of rapamycin treatment on tonic and phasic GABAergic inhibition in dentate granule cells after focal brain injury in mice[J].Exp Neurol,2016,280:30-40.

[19] Zeng LH,Rensing NR,Wong M.The mammalian target of rapamycin(mTOR)signaling pathway mediates epileptogenesis in a model of temporal lobe epilepsy[J].J Neurosci,2009,29(21):6964-6972.