蔡藝煌，鄧小玲，黃文霞，黃潔，紀(jì)晴， *，許銘炎，*

（1．廈門醫(yī)學(xué)院口腔系，廈門醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，福建廈門361002；2．廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部，福建廈門361002）

當(dāng)今世界，癌癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。在所有惡性腫瘤中，口腔惡性腫瘤占比約為3%，其中口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)則占90%[1]，并且其發(fā)病率在年輕群體中(小于40歲)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)[2]。在中國臺(tái)灣地區(qū)，口腔癌位列男性癌癥死亡第4位，而咀嚼檳榔是引發(fā)口腔癌的重要因素之一，其中每年每10萬人就有6人死于口腔癌[3]。此外，現(xiàn)代人長期高脂高蛋白及低纖維的飲食習(xí)慣容易造成消化系統(tǒng)的功能紊亂，進(jìn)而能引起口腔內(nèi)有害菌群生長，提高了口腔癌的發(fā)病率[4]。

血清應(yīng)答因子(serum response factor，SRF)是一個(gè)在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其在多種細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)中能與c-Fos/JunB、MRTFs、E-/VE-鈣黏著素/β-聯(lián)蛋白、RhoA和肌動(dòng)蛋白協(xié)同作用，在平滑肌的生理調(diào)控、胚胎干細(xì)胞早期基因激活、細(xì)胞增殖、分化、遷移以及干細(xì)胞的定向和血管生成等過程中發(fā)揮重要作用[5-12]。而目前，SRF在口腔惡性腫瘤中的研究較少，本研究通過構(gòu)建pLKO.1-hSRF慢病毒敲減質(zhì)粒，并成功感染口腔鱗癌細(xì)胞SAS，驗(yàn)證了其能在SAS細(xì)胞中敲減SRF mRNA 和 蛋白的表達(dá)水平，獲得SRF低表達(dá)口腔鱗癌細(xì)胞株，為后續(xù)口腔惡性腫瘤的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與載體慢病毒敲減質(zhì)粒pLKO.1-TRC cloning vector及293T細(xì)胞由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李博安教授惠贈(zèng)。SAS細(xì)胞購自日本細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器限制性內(nèi)切酶、DNA分子量Marker、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；膠回收試劑盒(Omega公司)；shRNA由廈門鉑瑞生物技術(shù)有限公司合成；DNA提取試劑盒、Super Real熒光定量預(yù)混試劑、T4DNA連接酶(TransGEN Biotech公司)；RNA提取試劑盒(東盛生物)；Turbofect轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛世爾，USA)；嘌呤霉素(Sigma，USA)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為賽默飛世爾公司7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 shRNA片段設(shè)計(jì)目的shRNA片段通過Thermo Fisher公 司 RNAi網(wǎng) 站 https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do進(jìn)行設(shè)計(jì)，獲取的核心片段序列為GCACTGATTCAGACCTGCCTCAACT，將該片段序列反向互補(bǔ)，以CTCGAG為loop環(huán)連接，并在頭尾兩端加上酶切位點(diǎn)，最終獲得如下引物序列：正向 5 ′-CCGG G CACTGATTCAGACCTGCCTCAACTC TCGAGAG TTGAGGCAGGTCTGAATCAGTGCTTTTTG-3′，反向5′-AATTCAAAAA G CACTGATTCAGACCTGCCTCAACTC TCGAGA GTTGAGGCAGGTCTGAATCAGTGC-3′(核心序列及其互補(bǔ)序列下劃線表示)。通過鉑瑞生物公司合成后，將獲得的片段溶解并進(jìn)行退火。本研究中以CTCGAG為loop環(huán)，由于使用pLKO.1-TRC質(zhì)粒系統(tǒng)，則以 EcoRⅠ和 A geⅠ作為插入片段的酶切位點(diǎn)。

1.2.2 克隆將公司合成的正反單鏈DNA片段溶解后(100μmol/L)各取2μL，加入到46μL的退火緩沖液[50 mmol/L HEPES(pH7.4)， 100mmol/L NaCl]中 進(jìn) 行 退火。退火程序95℃、5min，85℃、5min，75℃、5 min，70℃、10min，37℃、20min，4℃低溫保存獲取目的片段。然后用 EcoRⅠ和 A geⅠ對(duì)2μg pLKO.1載體進(jìn)行酶切，膠回收純化，然后將退火得到的目的片段稀釋200倍后用T4連接酶對(duì)酶切載體和目的片段進(jìn)行連接，22℃連接40min。再將連接產(chǎn)物加入到stbl3感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布到含氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16~18h。挑取單菌落加入到LB液體培養(yǎng)基中37℃搖動(dòng)培養(yǎng)16~18h。最后將培養(yǎng)好的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，并通過雙酶切進(jìn)行鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，以對(duì)克隆質(zhì)粒的序列進(jìn)行判定。獲得的陽性質(zhì)粒命名為pLKO.1-hSRF。

1.2.3 病毒包裝本研究中使用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，pVSV-G、pHR和新構(gòu)建質(zhì)粒pLKO.1-hSRF，以pLKO.1-Scramble作為陰性對(duì)照。將293T細(xì)胞接種到6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)16h左右，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%~90%時(shí)，使用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑將上述質(zhì)粒pVSV-G、pHR、 pLKO.1-hSRF或 pLKO.1-Scramble轉(zhuǎn) 染 到 細(xì) 胞中。轉(zhuǎn)染16~18h后換液，轉(zhuǎn)染40~48h后病毒即包裝并釋放到培養(yǎng)基中，收取培養(yǎng)基，用0.45μL濾器過濾后即獲得病毒溶液，將病毒分裝到1.5mL EP管中，每管1mL，液氮速凍后置于-80℃冰箱待用。

1.2.4 病毒感染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選將SAS細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，待其匯合度約為40%~50%左右時(shí)，加入Polybrane及適量病毒液，3.5cm培養(yǎng)皿加1 mL培養(yǎng)基和1mL病毒液。培養(yǎng)24h左右換液，培養(yǎng)40 h左右進(jìn)行傳代并加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，SAS的嘌呤霉素篩選終濃度約為0.2μg/mL，每隔2d換一次液，以未感染病毒的細(xì)胞為對(duì)照組， 1周后無感染病毒的對(duì)照組全死亡，而感染了病毒的實(shí)驗(yàn)組尚有大量細(xì)胞存活，表明SRF穩(wěn)定敲減的細(xì)胞株篩選成功。對(duì)獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)增和后續(xù)鑒定。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢驗(yàn)?zāi)康幕騧RNA敲減效率將感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細(xì)胞接種到直徑為3.5cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿后用RL溶液(東盛生物，RNA提取試劑盒)將細(xì)胞吹散下來加到EP管中，隨后按照說明書提取出細(xì)胞RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)獲得cDNA，用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑按照說明書與cDNA、引物及水按比例混勻后，使用ABI7500Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。以 G APDH作為內(nèi)參相對(duì)定量。所用引物為： S RF上游5′-CGAGATGGAGATCGGTATGGT-3′， 下 游5′-G GGTCTTCTTACCCGGCTTG-3′；GAPDH上游5′-CATCACCATCTTCCAGGAG-3′， 下 游5′-AGGC TGTTGTCATACTTCTC-3′。

1.2.6 Western blot檢驗(yàn)?zāi)康幕虻鞍浊脺p效率將感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細(xì)胞接種到6cm盤中，待細(xì)胞長滿后用細(xì)胞刮將目的細(xì)胞收集到EP管中，RIPA裂解液將細(xì)胞重懸裂解并超聲破碎，離心后去上清獲得目的細(xì)胞蛋白溶液，并用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，蛋白上樣量為40μg，電壓60V電泳40min后改為120V電泳90min，隨后利用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含10%脫脂牛奶的TBST對(duì)PVDF膜封閉1 h。將膜加入到一抗稀釋液中，4℃搖床孵育過夜。回收一抗，TBST漂洗3次，每次10min。加入二抗室溫?fù)u床孵育1h。棄去二抗，TBST漂洗3次，每次10min。在暗房中利用ECL發(fā)光液系統(tǒng)壓片，顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以x±s表示，感染pLKO.1-hSRF的實(shí)驗(yàn)組和感染pLKO.1-Scramble對(duì)照組的mRNA表達(dá)水平采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異性檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件分析， α =0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 克隆質(zhì)粒的獲得

空載質(zhì)粒pLKO.1-TRC全長8901bp，用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切后可得到7026bp和1875bp兩個(gè)片段。如圖1所示。將目的片段(7026bp)切膠回收后與退火片段用T4連接酶進(jìn)行連接，涂平板，然后挑取單克隆進(jìn)行后續(xù)酶切鑒定及測(cè)序。

圖1 空載質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒鑒定

設(shè)計(jì)的敲減片段中，loop環(huán)CTCGAG序列為 X hoⅠ的酶切位點(diǎn)，同時(shí)，選取pLKO.1質(zhì)粒1189bp處 K pnⅠ作為雙酶切鑒定位點(diǎn)，理論上可得到大小分別約為7 800bp和1200bp的片段。本實(shí)驗(yàn)挑取5個(gè)陽性克隆到培養(yǎng)瓶中搖菌并提取質(zhì)粒后，用 X hoⅠ和 K pnⅠ對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。電泳結(jié)果(圖2)顯示1、2、3、5質(zhì)粒被酶切出兩條片段，且酶切片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。選取酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與所設(shè)計(jì)片段序列一致，表明慢病毒敲減質(zhì)粒pLKO.1-hSRF構(gòu)建成功(圖3)。

圖2 酶切鑒定結(jié)果

圖3 陽性克隆質(zhì)粒測(cè)序圖

2.3 重組質(zhì)粒敲減效率的驗(yàn)證

2.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果以 G APDH為內(nèi)參，檢測(cè)感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細(xì)胞mRNA表達(dá)水平。如圖4所示，與Scramble對(duì)照組相比，感染pLKO.1-shSRF病毒的SAS細(xì)胞中SRF mRNA的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。

2.3.2 Western blot驗(yàn)證結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)感染pLKO.1-Scramble和pLKO.1-hSRF的SAS細(xì)胞蛋白表達(dá)水平變化，如圖5所示，在感染pLKO.1-hSRF病毒的SAS細(xì)胞中，SRF蛋白的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。

圖4 SAS 細(xì) 胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株S RF mRNA 的表達(dá)情況

圖5 SAS 細(xì) 胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 S RF 蛋白的表達(dá)情況

3 討論

血清反應(yīng)因子(SRF)是MADS-box家族中一類古老且進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子，在其N端帶有MADS結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能促進(jìn)其蛋白二聚化并具有DNA結(jié)合能力，而MADS結(jié)構(gòu)域的C端則具有與相關(guān)調(diào)控輔因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[13]。SRF的C端帶有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能被血清激活并磷酸化[14]。SRF參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、遷移、細(xì)胞骨架組織、能量代謝等有關(guān)的多種基因。理論上，SRF能通過識(shí)別被稱之為CArG-boxes的序列，進(jìn)而調(diào)控所有肌動(dòng)蛋白編碼基因和部分肌肉肌球蛋白重輕鏈以及對(duì)引起肌動(dòng)蛋白踏車現(xiàn)象的相關(guān)蛋白的調(diào)控[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，SRF在器官纖維化相關(guān)基因的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如ACTA2[15]和CTG[16]。且越來越多的研究[17-18]表明，心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子/血清反應(yīng)因子(MRTF/SRF)途徑有望將預(yù)防纖維化的靶點(diǎn)治療作為靶標(biāo)，在器官纖維化病變治療過程中具有較好的前景。此外，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，SRF作為重要的調(diào)控因子參與其中。如前列腺癌[19]、乳腺癌[20]、胃癌[21]等。在多種癌癥中，SRF呈現(xiàn)出高表達(dá)且在腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelialmesenchymal transition，EMT)中充當(dāng)重要的角色[22-23]。

然而，當(dāng)前SRF在口腔癌中的作用并未有詳細(xì)的研究論述。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SRF對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞中整合素的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，并在口腔鱗癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力中表現(xiàn)出了一定的影響。整合素是主要的細(xì)胞表面受體家族，能協(xié)調(diào)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)許多動(dòng)態(tài)細(xì)胞 黏 附過程，如遷移、擴(kuò)散和存活，進(jìn)而介導(dǎo)幾乎所有細(xì)胞的生命過程[24]。我們猜測(cè)SRF能通過整合素介導(dǎo)EMT過程，進(jìn)而影響口腔癌的發(fā)展。在本研究中，我們成功構(gòu)建了pLKO.1-hSRF，驗(yàn)證了其能夠在SAS細(xì)胞中敲減SRFmRNA和蛋白的表達(dá)水平，獲得了穩(wěn)定低表達(dá)SRF的口腔鱗狀癌細(xì)胞SAS。這對(duì)后續(xù)我們進(jìn)一步研究 SR F基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的功能作用奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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