呂榮榮，屈滿，岳營，邱月秀，尹立紅，李云暉*

（東南大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇南京210009）

戊唑醇(tebuconazole，TEB)是一種羥乙基三唑衍生物，屬于三唑類內吸收性殺菌劑，全球生產量大，在農業(yè)上應用廣泛，并在農作物、水體、土壤中有大量的殘留，在小溪中的最大殘余量為9.1μg/L[1]，對人類以及動物的健康造成了威脅。動物實驗表明三唑類殺菌劑具有哺乳動物生殖毒性[2]，可降低附睪和前列腺的質量，導致前列腺組織形態(tài)學的改變，精子數量的降低[3]。目前的研究表明，戊唑醇有生物富集性，有明顯的肝毒性，并可以導致甾類激素合成障礙，損害內分泌相關器官，可以導致雄性生物雌性化[4]。

秀麗線蟲(簡稱線蟲)，是研究生殖毒性的優(yōu)秀模式動物[5]。線蟲蟲體比較小，易于飼養(yǎng)，可以在短時間內獲得大量的實驗樣本，全身透明，易于進行熒光觀察，基因與人具有40%的同源性，實驗結果具有很好的外推性。包括哺乳動物與線蟲在內的有性生殖生物，生殖細胞從生殖干細胞到有活性的生殖細胞的過程具有高度的保守性。在雄性中，生殖細胞通過有絲分裂進行生殖干細胞的自我更新，經過兩次減數分裂形成單倍體配體，精細胞活化后成為可以受精的精子。與生殖相關的基因，線蟲與哺乳動物也具有高度同源性[6]。所以用秀麗線蟲作為模式生物研究環(huán)境毒物對精子發(fā)生過程的毒性作用具有較高的可靠性。本研究主要是利用秀麗線蟲的優(yōu)勢探討戊唑醇對于精子發(fā)生和精子形成過程的影響以及潛在的毒作用機制。

1 材料與方法

1.1 秀麗線蟲蟲株與培養(yǎng)方法

野生型N2、him-5(e1490)和fog-2(q71)蟲株均購于美國明尼蘇達大學線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetic Center，CGC)。him-5(e1490)，雄蟲突變體，有33%的雄蟲可以用于雄性生殖毒性方面的研究；fog-2(q71) 是雌蟲突變體，本身不產生精子，可與雄蟲進行雜交產生后代。本研究所用的所有基因型的秀麗線蟲均培養(yǎng)于加有大腸桿菌(OP50)的線蟲生長培養(yǎng)基(nematode growth media，NGM)，恒溫20℃培養(yǎng)。

1.2 主要試劑以及配制方法

戊唑醇，純度99.999%，購于百靈威科技公司；瓊脂糖、瓊脂 、 多聚蛋白胨、 膽固醇和二甲基亞砜均購于美國Sigma-Aldrich公司；二脒基苯基吲哚(DAPI)，購于中國Sigma-Aldrich公司；Pronase購于瑞士Roche公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；SYBR Green I購于日本Toyobo公司。

M9緩沖液：氯化鈉2.5g、磷酸氫二鈉3g、磷酸二氫鉀1.5g，加蒸餾水定容到500mL，高壓滅菌結束后加入0.5mL濃度為1mol/L的硫酸鎂，搖勻備用。

SM緩沖液：25mmol/L氯化鉀 、 45mmol/L氯化鈉 、 5mmol/L氯化鈣 、1 m mol/L 硫 酸鎂 、 50mmol/L HEPES，調整pH至7.6左右，過濾除菌，現用現配加入BSA或PVP，終濃度分別為1和10mg/mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 染毒方法將戊唑醇溶解于DMSO中，配制成1 mg/mL的儲備液，然后用無菌M9溶液稀釋成所需染毒濃度，設3個濃度組分別為0.1、1.0和10.0μg/L，并設定M9溶液為對照組。提前1d制作用于染毒的帶有NGM培養(yǎng)基的24孔板中，并加入OP50。將400μL配制好的染毒液滴至24孔板內，然后將L2期的秀麗線蟲[N2或者him-5(e1490)]加入染毒皿中，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中染毒直到L4期。

1.3.2 生育力和發(fā)育水平的測定染毒后的野生型N2線蟲用挑針隨機分別挑到10個新的并預置OP50的NGM培養(yǎng)基上，每24h轉一次板，直到線蟲不再產卵。對每個平板中的秀麗線蟲進行計數，并計算出每個線蟲的總后代數目。染毒后的秀麗線蟲挑到新的NGM培養(yǎng)基上，觀察產第1只卵的時間記為 t0，第1只卵孵化后挑入新的NGM培養(yǎng)基上，子一代產第1只卵的時間記為t1，世代時間為 t1-t0。

同時培養(yǎng)him-5(e1490)雄蟲突變株與fog-2(q71)雌蟲突變株。突變體fog-2(q71)發(fā)育到雌雄蟲株可以分辨時，將雌蟲挑入新的培養(yǎng)皿中單獨培養(yǎng)。him-5(e1490)雄蟲按照1.3.1的方法染毒結束后與fog-2(q71)雌蟲(young adult期)按1∶1的比例挑入提前加有 1滴OP50的新的NGM培養(yǎng)基上，12h雜交結束后將fog-2(q71)雌蟲挑入新的、加有OP50的NGM培養(yǎng)基上，每隔24h轉一次板，直至線蟲不再產卵，計算每個線蟲的總產卵數。每組至少計數10條。

1.3.3 生殖細胞計數[7]染毒后的him-5雄性秀麗線蟲用M9溶液洗滌3次，用挑針將線蟲挑至玻片上，用90%的酒精洗滌3次，加2μg/mL的DAPI染液，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡進行拍照觀察，經染色后生殖細胞核呈藍色，并整齊的排列在生殖腺內。整個實驗過程在恒溫環(huán)境下進行，并避光。將一列細胞中至少有2個或以上的具有新月形細胞核的細胞區(qū)域定義為過渡區(qū)(transition zone，TZ)[8]，頂體末梢細胞(distal tip cell，DTC)與TZ之間的細胞為有絲分裂細胞，TZ之后的細胞為減數分裂細胞，根據細胞核的形態(tài)確定區(qū)域后，計算有絲分裂區(qū)和減數分裂區(qū)生殖細胞的數目。

1.3.4 精細胞形態(tài)和大小的測定染毒結束后的him-5(e1490)雄蟲轉移到不含OP50的NGM培養(yǎng)基上，除去線蟲表面黏附的OP50。然后將線蟲挑入提前加有1滴精子緩沖液(sperm medium buffer，SMB)的玻片上，在顯微鏡下用1mL注射器輕劃線蟲尾部1/3處，釋放出精子。利用微分干涉相差顯微鏡進行精子形態(tài) 觀 察，并隨機選取視野進行拍照。每條線蟲不少于200個精細胞，每組不少于10條。利用Image-pro Plus，測量精細胞的直徑以及橫截面積。

1.3.5 精細胞體外活化能力的測定在載玻片上滴10 μL含Pronase E(200μg/mL)的SM緩沖液，挑入5~10條染毒結束后除去OP50的him-5(e1490)雄蟲至緩沖液中，用1mL注射器從線蟲尾部1/3處劃開，釋放精細胞，10 min后用微分干涉差顯微鏡隨機選取視野，觀察精細胞能否形成正常偽足(應保證液體不會干)，出現正常偽足即可視為活化；隨機選取若干視野計數，每條線蟲計數不少于100個精細胞，并計算其活化率。每個濃度組10條，實驗重復3次。

1.3.6 RNA的提取以及實時熒光定量PCR用Trizol法提取him-5(e1490)線蟲的總RNA，然后逆轉錄成cDNA進行實時熒光定量PCR(quantitativereal-time PCR，qPCR)。引物根據線蟲數據庫的序列(http://www.wormbase.org)以及美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)進行設計，具體的引物序列見表1。反應體系為：SYBR GreenIMasterMix8μL，SYBR GreenIMaster Plus2μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.2μL，去離子水6.6μL，cDNA 1μL，組成20μL反應體系。根據引物序列確定退火溫度，擴增步驟為94℃預變性5min，94℃、 5s，52℃退火30s(a ge-1， d af-2， d af-16基因)；或54℃退火30 s(s w m-1， spe-6， a kt-1， spe-4， tr y-5， fer-1基因)，采集熒光信號，40個循環(huán)；72℃、10min延伸，act-1作為內參照，采用相對定量法測定精子發(fā)生相關nsulin/IGF信號通路基因daf-2， a kt-1， a kt-2， d af-16以及SWM-1信號通路基因try-5， s pe-4， s pe-6，fer-1的mRNA相對表達水平。每個基因設定3個平行樣，實驗重復3次。

表1 精子發(fā)生與精子形成相關基因的引物序列(5′- 3 ′)

1.4 統計學方法

利- 用 SPSS17.0統計軟件進行數據分析處理，結果采用x±s 表示，后代數目、生殖細胞數、精細胞直徑、精細胞橫截面積以及相關基因mRNA的表達水平組間的比較采用單因素方差分析，不同染毒劑量組分別與對照組之間差異的分析采用Dunnet’s t檢驗，其中檢驗水準 α=0.05。精細胞活化率的差異分析采用 χ2檢驗，不同染毒劑量組分別與對照組之間差異的分析采用四格表 χ2檢驗，并校準α 值。

2 結果

2.1 戊唑醇對秀麗線蟲生育力與發(fā)育水平的影響

為了探討戊唑醇是否對秀麗線蟲具有生殖毒性，我們觀察了野生型N2染毒后的后代數目，結果見圖1A，可以看出戊唑醇劑量為10.0μg/L時可以引起野生型秀麗線蟲后代數目的降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。染毒后N2的世代時間無明顯差異(圖1B)，表明這種后代數目的差異是由染毒后線蟲生育力降低引起的，而非線蟲發(fā)育不良所導致。為了進一步探討這種后代數目的差異是否是由于精子受損引起的，我們觀察了him-5(e1490)染毒后雜交后代數目，結果如圖1C所示，戊唑醇染毒后 ， 1.0和10.0μg/L劑量組均表現為后代數目的降低，差異具有統計學意義(P<0 .05)，表明戊唑醇染毒后可以導致精子的產生過程受損。

2.2 戊唑醇對精子發(fā)生過程的毒作用

2.2.1 戊唑醇對線蟲生殖腺生殖細胞數目的影響見圖2。him-5(e1490)秀麗線蟲戊唑醇染毒后，與對照組相比，戊唑醇在1.0和10.0μg/L劑量組有絲分裂細胞數(圖2A)，減數分裂細胞數(圖2B)，總生殖細胞數(圖2C)均明顯減少，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。說明戊唑醇可以影響精子的發(fā)生過程，導致生殖毒性。

圖2 戊唑醇染毒后對秀麗線蟲生殖腺生殖細胞的影響

2.2.2 戊唑醇對精細胞數目的影響見 圖 3。1.0和10.0μg/L戊唑醇染毒后，精細胞的數目與對照組相比明顯降低(P均<0.05)。進一步表明戊唑醇對精子發(fā)生過程產生了影響，導致精細胞數目的降低，從而產生生殖毒性。

圖3 戊唑醇染毒后對精細胞數目的影響

2.3 戊唑醇對精子形成過程的毒作用

戊唑醇染毒后，秀麗線蟲精細胞的形態(tài)并未發(fā)現明顯異常，非圓細胞的數量并未見明顯增多，但戊唑醇染毒后精細胞的大小明顯受到影響，精細胞的直徑與面積都較對照組有明顯的降低 (P 均<0.01)；利用pronase對染毒后him-5(e1490)秀麗線蟲的精細胞進行體外活化，不能正常伸出偽足的精細胞視為未能正?；罨木毎?。發(fā)現1 .0 和 1 0 μg/L戊唑醇染毒后未活化的精細胞數目明顯增多，精細胞的活化率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，見表2。

2.4 戊唑醇對秀麗線蟲精子發(fā)生以及精子形成相關基因表達的影響

2.4.1 戊唑醇對精子發(fā)生相關基因表達的影響戊唑醇暴露后對秀麗線蟲精子發(fā)生相關的4種mRNA表達水平的影響見表3。與對照組相比，daf-2、akt-1、daf-16mRNA在1.0和10.0μg/L染毒劑量組的表達量均上升(P均<0.01)；age-1mRNA在 0.1~10.0μg/L染毒劑量組的表達量均明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 不同濃度戊唑醇暴露后秀麗線蟲精細胞大小及活化能力的影響

2.4.2 戊唑醇對精子形成相關基因表達的影響戊唑醇染毒后對秀麗線蟲精子形成相關 5種基因mRNA表達水平的影響見表4。戊唑醇暴露后與對照組相比精子形成相關基因 tr y-5、 spe-4、 spe-6、 fer-1的mRNA表達量均明顯上升(P <0.05或P<0.01)；swm-1mRNA在1.0 μg/L劑量組表達量上升，差異具有統計學意義(P<0.01)。

表3 戊唑醇暴露后秀麗線蟲精子發(fā)生相關基因 m RNA的相對表達水平

表4 不同濃度戊唑醇暴露后秀麗線蟲精子形成相關基因 m RNA的相對表達水平

3 討論

三唑類殺菌劑是全球十大農藥之一，通過抑制麥角固醇的合成而達到殺菌的目的[9]，與其他農藥相比，三唑類殺菌劑在全球有更大的消費量[10]。戊唑醇是一種常見的三唑類殺菌劑，被廣泛應用于農作物、蔬菜、水果的菌害控制。殘留在蔬菜水果中的戊唑醇的半衰期大約是6d[11]，人可以通過進食攝入殘留的戊唑醇以及在從事相關職業(yè)時通過呼吸和皮膚攝入戊唑醇。在從事農業(yè)生產人的尿中檢測出戊唑醇的兩個代謝產物TEB-OH以及TEB-COOH的量分別是8.0~387.8 g/L(0.025~1.198mol/L)以及5.7~102.9g/L(0.017~0.305 mol/L)[12-13]。因為戊唑醇的環(huán)境殘留量以及職業(yè)暴露可能會對人類的健康造成威脅，目前對戊唑醇的毒性研究越來越多。

目前的研究表明，三唑類殺菌劑的重要作用靶點是肝臟，可以引起肝臟毒性[14]。也有研究表明三唑類殺菌劑會抑制甾醇類化合物的合成或者釋放從而損傷內分泌相關器官[15]。哺乳動物研究表明三唑類殺菌劑具有生殖毒性[3]，表現為前列腺和附睪組織質量的減輕，前列腺組織形態(tài)學的改變以及后代精子數量的降低。本文以秀麗線蟲作為模式生物，研究戊唑醇的生殖毒性及其潛在的影響基因。

秀麗線蟲身體小，易于飼養(yǎng)，全身透明易于熒光觀察，短時間內可以獲得大量的實驗樣本以及突變體易于獲得等優(yōu)點使線蟲成為研究化學物質毒性的優(yōu)秀模式動物。秀麗線蟲野生型N2有兩個U型性腺臂，每個性腺含有143個體性腺細胞以及大于1000個生殖細胞，秀麗線蟲雄蟲突變體只有1個性腺，包含56個體性腺細胞以及大于1 0 00個生殖細胞[16]，大量的生殖細胞易于進行生殖毒性的研究。秀麗線蟲和哺乳動物的生殖細胞均是從生殖干細胞開始經過有絲分裂與減數分裂，由二倍體生殖干細胞形成單倍體配子，再完成受精等一系列的生殖過程并形成新的生命體。秀麗線蟲生殖細胞從頂體末梢細胞開始隨時間在性腺上向納精囊方向遷移，所以位于不同發(fā)育狀態(tài)的生殖細胞定位在性腺的不同部位，易于區(qū)分與觀察。因此，我們選擇秀麗線蟲作為模式生物研究戊唑醇的雄性生殖毒性。

首先我們用野生型秀麗線蟲N2的后代數目作為指標探討戊唑醇是否具有生殖毒性，世代時間作為發(fā)育指標探討發(fā)育毒性。實驗結果表明戊唑醇可以導致秀麗線蟲后代數目的減少，世代時間并沒有統計學差異，表明此劑量下，戊唑醇導致的秀麗線蟲生育力的降低很有可能是生殖細胞受損導致的并不是由于發(fā)育低下引起的。目前的研究表明戊唑醇具有雄性生殖毒性，可以導致睪丸和附睪質量的降低，所以我們又觀察了him-5(e1490)雄蟲染毒后與fog-2(q71)雜交之后的后代數目，實驗結果表明，雜交之后的后代數目也較對照組降低，表明戊唑醇暴露后可以導致雄性生殖毒性。

生殖細胞攜帶遺傳信息完成生物信息的世代傳遞，是聯系有性生殖生物過去、現在和未來的紐帶。在這個過程中，含有兩份遺傳信息的生殖干細胞經過一系列復雜的過程生成單倍體的配子，然后完成受精過程形成新的生物體。對于雄性來說，雙倍體的精母干細胞歷經精子的發(fā)生過程產生單倍體的配子，然后通過精子的形成過程產生有功能的、活化的、可以受精的精子[17]。在精子的發(fā)生過程中，生殖干細胞通過有絲分裂維持生殖細胞的數量，經過減數分裂進行分化產生單倍體的配體。在這個過程中受多種信號通路的調控，Insulin/IGF信號通路是其中關鍵的調控通路之一[18]。并且有研究表明戊唑醇會導致激素合成障礙，所以我們懷疑Insulin/IGF信號通路可能是戊唑醇染毒后導致生殖毒性的作用機制之一。實驗結果表明，戊唑醇染毒后有絲分裂區(qū)的細胞以及減數分裂區(qū)的細胞數目與對照組相比均降低，提示戊唑醇損害精子發(fā)生過程，精子發(fā)生過程產生的精細胞數目染毒劑量組與對照組相比也降低，進一步驗證了精子發(fā)生過程的異常。IGF-1通路包括DAF-2/IGF-1受體(IGF-1R)、磷脂酰肌醇3-激酶(AGE-1/PI3K)、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK1)、AKT-1/2和血清與糖皮質激素誘導的蛋白激酶(SGK-1)5部分。細胞外信號通過DAF-2/IGF-1R轉導，刺激AGE-1/PI3K活化后產生次級信號激活PDK1、AKT-1/2及SGK，調節(jié)轉錄因子Forkhead box class O(DAF-16/FOXO)的活性，最終調節(jié)生殖細胞分裂周期[19]。與對照組相比，daf-2、akt-1、daf-16 mRNA在1.0和10.0μg/L戊唑醇染毒劑量組表達量均上升；age-1mRNA在各染毒組表達量均明顯下降。表明戊唑醇可能是通過影響IGF-1通路相關基因的表達，導致精子發(fā)生過程的異常，從而產生生殖毒性。daf-16基因編碼線蟲box O(FOXO)同系物蛋白；daf-16作為一種轉錄因子參與調節(jié)秀麗線蟲生命的很多過程，包括壽命、脂肪代謝 、 應激反應和先天免疫調節(jié)等并受多種基因調控[20-21]；daf-16可以響應并且協同其他基因參與DNA損傷過程，減輕DNA損傷導致的發(fā)育停滯[22]；在我們的實驗結果中，戊唑醇染毒后，位于不同時期的生殖細胞的數目都有不同程度的降低，但是細胞的發(fā)育過程并沒有受損，生殖干細胞依然可以經過有絲分裂、減數分裂等一系列的過程發(fā)育成精細胞，生殖腺的組織形態(tài)也沒有發(fā)生明顯的改變，所以 d af-16基因的高表達可能與其減輕DNA損傷有關。

生殖干細胞經過精子的發(fā)生過程生成精細胞，精細胞必須經過活化并具有一定的遷移能力才能到達子宮與卵子結合完成受精。精細胞成為有活力的可以受精的精子的這個過程稱為精子的形成。雄性家兔實驗表明三唑類殺菌劑可以減少精子的數量，使精子的形態(tài)以及運動能力異常[23]。我們的實驗結果表明，與對照組相比戊唑醇并沒有導致秀麗線蟲精子形態(tài)的改變，但是與對照組相比精子相對比較小，表現為精子直徑以及橫截面積的降低。精細胞體外活化的能力較對照組也降低，表明戊唑醇染毒后可以影響精子形成過程。SWM-1信號通路是調節(jié)精子形成過程的關鍵通路之一[24]。SWM-1蛋白酶抑制劑抑制TRY-5蛋白酶的活化后激活相應的可傳入精子細胞內信號，進而抑制SPE-6激酶的活性，激活SPE-4并與FER-1分離，之后MO和細胞膜融合，從而活化精子細胞，形成具有運動活力的精子[25]。我們的研究結果表明，與對照組相比，戊唑醇暴露后精子形成相關基因try-5， spe-4，spe-6， fer- 1 的mRNA表達量均明顯上升， swm-1基因1μg/L 劑量組基因表達量上升，提示戊唑醇可能是通過SWM-1信號通路相關基因的表達影響精子形成過程，導致精子變小，并且活化能力降低。精子的形成過程是一個非常復雜的過程，各種信號通路參與其中，相互調節(jié)，SWM-1蛋白可以抑制精子在交配前活化，從而確保雄性的生殖能力，因為無法成功的轉運已經活化的精子，swm-1突變體的雄蟲不具有生殖能力[26]；精液蛋白酶TRY-5是秀麗線蟲中精子的活化啟動器可以啟動精子的活化[27]，雌雄同體交配后，TRY-5蛋白從性腺釋放并伴隨著精子的遷移轉移到雌性秀麗線蟲體內，使精子在合適的時間活化[27]。SPE-6是類酪蛋白激酶1蛋白，在精子發(fā)生過程中精細胞的分裂[28]以及精子的活化方面均發(fā)揮作用[29]， spe-6基因突變體雄蟲的精子也會提早活化，從而導致生殖能力的降低[29]。SPE-6蛋白同時參與SPE-8信號通路的精子活化途徑，并且起負調控作用，而且精子形成的發(fā)動需要下降的SPE-6蛋白的表達[30]，在我們的實驗結果中，try-5、 spe-4、 fer-1基因表達量的上升，表明戊唑醇可以使精子在雄蟲體內過早的成熟，可能也是導致雄蟲體內儲存的精細胞數目降低的原因之一，而 spe-6基因表達量的上升，表明在交配后，戊唑醇影響了雄蟲的精子在雌蟲體內激活SPE-8信號通路，從而使有幸生存下來的可以進入雄蟲體內的精子的活化率降低，最終導致生殖能力的下降；此外，因為 spe-6基因同時參與精子發(fā)生的過程的調控， spe-6基因表達量的上升，可能還受其他基因的影響。

總的來說，戊唑醇可以通過影響IGF-1通路相關基因的表達從而使生殖腺生殖細胞數目降低，減少精細胞的數量從而影響精子的發(fā)生過程；使SWM-1信號通路相關基因的表達量上升，降低其作用從而使MO與細胞膜無法融合，不但使精細胞變小，并且使精細胞的活化異常，從而產生生殖毒性。

[1]BERENZEN N，LENTZEN-GODDING A，PROBSTM，et al.A comparison of predicted and measured levels of runoff-related pesticide concentrations in small lowlanDStreams on a landscape level[J].Chemosphere，2005，58(5)：683-691.

[2]VIEIRAM L，COSTA N O，PEREIRAM R F，et al.Chronic exposure to the fungicide propiconazole：Behavioral and reproductive evaluation of F1and F2generations of malerats[J].Toxicology，2017，389(1)：85-93.

[3]JACOBSEN P R， AXELSTADM， BOBERGJ， et al.Persistent developmental toxicity in rat offspring after low dose exposure to a mixture of endocrine disrupting pesticides[J].Reprod Toxicol，2012，34(2)：237-250.

[4]TAXVIG C，HASS U，AXELSTADM，et al.Endocrinedisrupting activities in vivo of the fungicides tebuconazole and epoxiconazole[J].Toxicol Sci，2007，100(2)：464-473.

[5]ZANNI E，DE BELLIS G，BRACCIALEM P，et al.Graphite nanoplatelets and Caenorhabditis elegans：insights from an in vivo model[J].Nano Lett，2012，12(6)：2740-2744.

[6]CHU DS，LIU H，NIX P，et al.Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors[J].Nature，2006，443(7107)：101-105.

[7]SHAHAM S.Methods in cell biology[J/OL].WormBook，2006.doi：10.1895/wormbook.1.49.1.

[8]CINQUIN O，CRITTENDEN S L，MORGAN D E，et al.Progression from a stem cell-like state to early differentiation in the C.elegans germ line[J].Proc Natl AcaDSci U S A，2010，107(5)：2048-2053.

[9]SONG Z，NES W D.Sterol biosynthesis inhibitors：potential for transition state analogs and mechanism-based inactivators targeted at s terol m ethyltransferase[J]. L ipids，2007，42(1)：15-33.

[10]FENNER K， CANONICA S， WACKETTL P， et al.Evaluating pesticide degradation in the environment：blinDSpots and emerging opportunities[J].Science， 2013， 341(6147)：752-758.

[11]ZHANG Q， HUA X，YANGY， et al.Stereoselective degradation of flutriafol and tebuconazole in grape[J].Environ Sci Pollut Res Int，2015，22(6)：4350-4358.

[12]FUSTINONI S，MERCADANTE R，POLLEDRI E，et al.Biological monitoring of exposure to tebuconazole in winegrowers[J].J Expo Sci Environ Epidemiol，2014，24(6)：643-649.

[13]MERCADANTE R， POLLEDRI E， SCURATI S， et al.Identification and quantification of metabolites of the fungicide tebuconazole in human urine[J].Chem Res Toxicol，2014，27(11)：1943-1949.

[14]NESNOW S，WARD W，MOORE T，et al.Discrimination of tumorigenic triazole conazoles from phenobarbital by transcriptional analyses of mouse liver gene expression[J].Toxicol Sci，2009，110(1)：68-83.

[15]TAXVIG C，VINGGAARD AM，HASS U，et al.Do parabens have the ability to interfere with steroidogenesis?[J].Toxicol Sci，2008，106(1)：206-213.

[16]KIMBLEJ，HIRSH D.The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans[J].Dev Biol，1979，70(2)：396-417.

[17]MA X，ZHAOY，SUN W，et al.Transformation：How do nematode sperm become activated and crawl?[J].Protein Cell，2012，3(10)：755-761.

[18]ESCOTTGM，DA ROSA L A，LOSS EDA S.Mechanisms of hormonal regulation of sertoli cell development and proliferation：a key process for spermatogenesis[J].CurrMol Pharmacol，2014，7(2)：96-108.

[19]HUBBARD EJ，KORTA D Z，DALFO D.Physiological control of germline development[J].Adv ExpMed Biol，2013，757：101-131.

[20]KWON ES，NARASIMHAN S D，YEN K，et al.A new DAF-16isoform regulates longevity[J].Nature，2010，466(7305)：498-502.

[21]HENDERSONST，JOHNSON TE.daf-16integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans[J].Curr Biol， 2001，11(24)：1975-1980.

[22]DAITOKU H，KANEKOY，YOSHIMOCHI K，et al.Nontranscriptional function of FOXO1/DAF-16contributes to translesion DNA synthesis[J].Mol Cell Biol，2016， 3 6(21)：2755-2766.

[23]COSTA N O，VIEIRAM L，SGARIONI V，et al.Evaluation of thereproductive toxicity of fungicide propiconazole in malerats[J].Toxicology，2015，335：55-61.

[24]TECHNAU GM.Advances in ExperimentalMedicine and Biology.Brain development in Drosophila melanogaster.Preface[J].Adv ExpMed Biol，2008，628：5 -6.

[25]CHU DS，SHAKESDC.Spermatogenesis[J].Adv ExpMed Biol，2013，757：171-203.

[26]STANFIELD GM，VILLENEUVE AM.Regulation of sperm activation by SWM-1is required for reproductive success of C.elegans males[J].Curr Biol，2006，16(3)：252-263.

[27]SMITHJR，STANFIELDGM.TRY-5is a sperm-activating protease in Caenorhabditis elegans seminal fluid[J].PLoS Genet，2011，7(11)：e1002375.

[28]VARKEYJP，JANSMA PL，MINNITIAN，et al.The Caenorhabditis elegans spe-6gene is required for major sperm protein assembly anDShows seconDSite non-complementation with an unlinked deficiency[J].Genetics，1993，133(1)：79-86.

[29]MUHLRAD PJ，WARDS.Spermiogenesis initiation in Caenorhabditis elegans involves a casein kinase1encoded by the spe-6gene[J].Genetics，2002，161(1)：143-155.

[30]NISHIMURA H，L'HERNAULTS W.Spermatogenesisdefective(spe)mutants of the nematode Caenorhabditis elegans provide clues to solve the puzzle of male germline functions during reproduction[J].Dev Dyn，2010，239(5)：1502-1514.