周文娟，雷志明，魏雪濤，郝衛(wèi)東*

（北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系/食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京100191）

刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)可以通過尾靜脈注射，特異性作用于小鼠肝臟，造成肝臟損傷[1]。關(guān)于該損傷機制的研究顯示，Con A并不直接作用于小鼠肝細胞[2]，但可以引起肝臟內(nèi)免疫細胞和相關(guān)細胞因子的聚集，進而誘導免疫介導的肝臟損傷[3]。Con A誘導的肝損傷常被用于模擬自身免疫性肝炎和乙型病毒性肝炎等，具有時間短和損傷具有劑量反應(yīng)關(guān)系等特點[1，4-6]。

研究表明，枯否細胞(Kupffer cell，KC)是Con A誘導免疫性肝損傷中的關(guān)鍵性非實質(zhì)細胞，樹突狀細胞(dendritic cell，DC)也在該損傷中起到一定的作用。CD11c是KCs和DCs的表面分子[7]，與KCs和DCs有關(guān)且參與Con A誘導的免疫性肝損傷的細胞因子有腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、 γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素(IL-4/5/6 /12)等。這些因子中最關(guān)鍵的為TNF-α和IFN-γ。

轉(zhuǎn)化生長因子 β激活激酶1(TGFβ-activated kinase 1，TAK1)，是一種體內(nèi)常見的蛋白激酶，參與細胞的增殖與分化，在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[8-9]。目前已有部分研究探討了TAK1與肝損傷之間的關(guān)系[10-11]。Song等[12]研究表明肝實質(zhì)細胞敲除TAK1可以誘導自發(fā)性肝炎、肝纖維化和肝癌。然而僅有少量研究探討了肝中非實質(zhì)細胞TAK1在該損傷中的作用，尚未見有關(guān)CD11c+細胞中TAK1敲除對于該損傷的研究。因此，本文利用在CD11c+細胞中特異性敲除TAK1基因的動物模型，研究免疫細胞中TAK1在Con A誘導的早期免疫性肝損傷中所起的作用，旨為臨床肝炎治療新靶點的探索提供理論線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

FloxedMap3k7(Map3k7fl/fl) 和CD11c-Cre小鼠購自美國Jackson實驗室，該小鼠為C57BL/6背景。將Map3k7fl/fl和CD11c-Cre小鼠進行交配，產(chǎn)生Map3k7fl/flCD11c-Cre小鼠，該小鼠體內(nèi)CD11c+細胞中特異性缺失Map3k7(TA K1)基因。對照C57BL/6小鼠為帶有CD11c-Cre的小鼠，以排除Cre的影響[13]。

所有小鼠均選取雌性，8~12周齡，SPF級，體質(zhì)量18~22g，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，溫度20~25℃，相對濕度40%~70%，12h/12h明暗交替循環(huán)，飼料為符合國家標準的無菌飼料，飲用水經(jīng)過濾除菌處理。動物實驗符合北京大學動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

將CD11c+細胞特異性敲除TAK1的C57BL/6小鼠，經(jīng)鼠尾靜脈注射Con A(12mg/kg)或生理鹽水，分別作為Con A敲除組和生理鹽水敲除組。另選C57BL/6小鼠，鼠尾靜脈注射Con A(12mg/kg)或生理鹽水，作為Con A對照組和生理鹽水對照組，共4組，每組7只。注射6h之后取血，斷髓處死動物，進行相關(guān)指標檢測。

1.2 試劑與儀器

Ⅳ型刀豆蛋白A(Con A)購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alamine aminoteansferase，ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)以及乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自四川麥克生物科技股份有限公司；小鼠TNF-α、小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 試劑盒和多因子小鼠Th1/Th2檢測試劑盒(6因子)購自eBioscience公司。

HITACHI-7170A全自動生化分析儀為日本日立公司產(chǎn)品；ThermoMK3型酶標儀為中國賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；正置熒光顯微鏡(Nikon E400)，realtime PCR擴增儀為Bio-Rad產(chǎn)品。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 小鼠血清ALT、AST、LDH測定小鼠眼部取血，4℃靜置1h后，2500r/min離心10min，取上清，全自動生化分析儀檢測ALT、AST和LDH活性。

1.3.2 小鼠臟器系數(shù)計算動物麻醉后處死，摘取肝、脾、肺、腎和胸腺，稱取質(zhì)量并計算臟器系數(shù)。

1.3.3 小鼠肝臟病理學觀察及評分制備肝臟病理切片，進行HE染色，光學顯微鏡觀察，定性描述相關(guān)的病理學特征。根據(jù)肝臟病變程度按照如下標準分為4級：0級，正常肝組織，記0分；1級，輕度炎性細胞浸潤，偶伴有單個肝細胞壞死，記1分；2級，中度肝細胞損害伴炎癥細胞浸潤和局灶性肝細胞壞死，記2分；3級，匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)廣泛炎癥細胞浸潤，伴廣泛的肝細胞壞死[14]。

1.3.4 小鼠血清中白細胞介素、TNF-α和IFN-γ表達測定收集小鼠血清，酶標儀測定450和570nm處白細胞介素IL-4/5/6/12、TNF-α和IFN-γ的吸光度值，計算細胞因子含量。

1.3.5 小鼠肝中TNF-α和IFN-γ表達測定取少量肝組織進行勻漿，12000r/min離心20min，取上清，酶標儀測定450nm和570nm處TNF-α和IFN-γ的吸光度值，計算細胞因子含量。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)分析，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗，兩組均數(shù)之間比較采用t檢 驗，方差不齊時采用t檢驗； α=0.05為檢驗水準。在對免疫相關(guān)細胞因子分析時，剔除數(shù)值超過兩倍標準差的異常數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 CD11c+細胞中特異性敲除TAK1對血清生化指標的影響

與生理鹽水對照組相比，生理鹽水敲除組小鼠血清中ALT、AST和LDH水平無顯著改變，Con A對照組中血清ALT和LDH水平顯著升高(P均<0.05)。與Con A對照組相比，Con A敲除組小鼠血清ALT、AST和LDH水平均顯著升高(P均<0.05)。見表1。

表1 CD11c+細胞中特異性敲除TAK1對小鼠血清生化指標的影響(-x±s，n=7)

2.2 CD11c+細胞中特異性敲除TAK1對臟器系數(shù)的影響

與生理鹽水對照組相比，生理鹽水敲除組小鼠僅肝臟系數(shù)顯著升高(P<0.05)，Con A對照組肝臟和脾臟臟器系數(shù)顯著升高(P均<0.05)。與Con A對照組相比，Con A 敲除組 小 鼠的肝臟、肺臟和腎臟臟器系數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，脾臟和胸腺臟器系數(shù)無明顯改變。見表2。

表2 CD11c+細胞特異性敲除 TAK1對臟器系數(shù)的影響(-x±s，n=7)

2.3 CD11c+細胞中TAK1特異性敲除對Con A引起的肝組織病理損傷的影響

與生理鹽水對照組(0分)相比，生理鹽水敲除組小鼠肝臟病理評分(0.43±0.53)無明顯改變，Con A對照組病理評分(2.14±0.69)則顯著升高(P<0.05)。與Con A對照組相比，Con A敲除組病理評分(2.86±0.38)顯著升高(P<0.05)。Con A對照組損傷主要表現(xiàn)為點灶狀壞死或匯管區(qū)炎癥，其中前者表現(xiàn)更為顯著而普遍，匯管區(qū)周圍存在輕度壞死，肝小葉內(nèi)肝細胞的壞死以點灶狀為主，無明顯的片狀或橋接壞死；Con A敲除組損傷類型由早期壞死轉(zhuǎn)變?yōu)槊黠@的灶狀壞死或匯管區(qū)炎癥，有明顯的片狀壞死和橋接壞死，同時存在多個出血壞死灶。所有肝臟均未見明顯纖維化表現(xiàn)。見圖1。

2.4 CD11c+細胞中TAK1特異性敲除對Con A誘導的血清免疫因子表達的影響

與生理鹽水對照組相比，生理鹽水敲除組 小 鼠血清各細胞因子水平均未見明顯改變，Con A對照組血清TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，血清IL-12水平無明顯改變。與Con A對照組相比，Con A敲除組血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，而血清IFN-γ、IL-5和IL-12水平無明顯改變。見圖2。

2.5 CD11c+細胞中TAK1特異性敲除對Con A誘導的肝組織中TNF-α和IFN-γ表達的影響

見圖 3。與生理鹽水對照組比較，生理鹽水敲除組 小 鼠肝組織中TNF-α的含量明顯下降(P<0.05)，IFN-γ水平無明顯改變；Con A對照組肝組織中兩因子均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與Con A對照組相比，Con A敲除組小鼠肝組織中IFN-γ水平顯著升高， 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TNF-α水平無明顯改變。

圖1 CD11c+ 細 胞特異性敲除TAK1 對C on A 引 起的肝臟病理組織學的影響(H E， ×200)

圖2 CD11c+ 細 胞中TAK1 特 異性敲除對 C on A 誘 導的血清細胞免疫因子表達的影響(n=5)

圖3 CD11c+ 細 胞中TAK1 特 異性敲除對C on A 誘 導的肝細胞因子的影響(n=5)

3 討論

Con A是一種從刀豆中提取出來的蛋白。1992年Tiegs等[4]首次發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射Con A可以特異性引起小鼠的免疫性肝損傷。Con A入血之后主要聚集在肝中，并作用于肝竇內(nèi)皮細胞，使細胞破損。之后該蛋白會穿過肝竇內(nèi)皮與Kupffer細胞結(jié)合，激活肝中的免疫反應(yīng)，聚集的免疫細胞和因子會進一步作用于肝細胞，造成肝細胞的變性和壞死[3]。Con A誘導免疫性肝損傷主要表現(xiàn)為血生化指標升高和肝臟病理損傷加重[15]。本課題組前期研究顯示，當Con A鼠尾靜脈注射劑量為12mg/kg時，實驗小鼠的肝臟存在輕度損傷，肝和血清中TNF-α和IFN-γ的水平均升高。故本實驗Con A注射劑量均為12mg/kg，以便于探索CD11c+細胞中TAK1蛋白對于Con A誘導的免疫性肝損傷的作用。

本研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，Con A敲除組和Con A對照組反映肝損傷嚴重程度的血生化指標顯著升高(P均<0.05)，而生理鹽水敲除組的血生化無明顯改變。Con A敲除組的血生化指標明顯高于Con A對照組(P均<0.05)。肝臟病理及病理評分變化與血生化一致。提示單獨敲除CD11c+細胞中的TAK1并不會引起肝細胞明顯的損傷和死亡，造成肝臟的明顯損傷。這也說明CD11c+細胞中的TAK1蛋白可能并不直接參與維持肝細胞的存活。但是CD11c+細胞中TAK1 的敲除對于Con A誘導的免疫性肝損傷起協(xié)同作用，TAK1敲除可使肝臟對于外來刺激更加敏感。CD11c+細胞中的TAK1蛋白參與了Con A誘導的免疫性肝損傷。Wang等[16]曾證明在CD11c+細胞特異性敲除TAK1的小鼠中TAK1缺失導致CD11c+細胞凋亡顯著上升，從而致淋巴和非淋巴組織中的DCs群體枯竭。DCs 的缺失可以進一步導致肝中免疫穩(wěn)態(tài)失衡。Tomiyama 等[17]發(fā)現(xiàn)Con A給藥小鼠的肝樹突狀細胞過繼性轉(zhuǎn)移有抑制Con A誘導肝損傷的作用。提示CD11c+細胞中特異性敲除TAK1很有可能是通過DCs凋亡，造成肝中免疫穩(wěn)態(tài)失衡，進而加重Con A誘導的肝損傷。然而近期也有報道稱CD11c-白喉毒素受體轉(zhuǎn)基因小鼠或用抗CD11c抗體導致小鼠CD11c+D C枯竭，可減輕Con A誘發(fā)的肝損傷[18]。該結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，其可能原因為文獻中起關(guān)鍵作用的DCs為常規(guī)樹突狀細胞(cDC)，而小鼠肝中的DC為漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)[19]，雖然均為樹突狀細胞，兩者在免疫反應(yīng)中所起作用不同。漿細胞樣樹突狀細胞參與維持免疫耐受[20]。

KCs和DCs可以通過分泌一系列細胞因子，進一步誘導免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，生理鹽水敲除組的肝TNF-α水平降低(P<0.05)，而其他細胞因子均無明顯改變。Con A對照組中血清和肝勻漿中細胞因子除IL-12外水平均升高(P均<0.05)。與Con A對照組相比，Con A敲除組的肝IFN-γ，血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均顯著升高(P均<0.05)，肝TNF-α和血清IFN-γ、IL-5和IL-12水平未見明顯改變。表明CD11c+細胞的TAK1蛋白與免疫性肝損傷有關(guān)，該細胞中TAK1敲除可影響Con A誘導的免疫性肝損傷中細胞因子的分泌，加重肝臟炎癥。但CD11c+細胞中TAK1的敲除不會影響血清IL-5 和IL-12的分泌。

TNF-α和IFN-γ是Con A誘導免疫性肝損傷中的關(guān)鍵因子，而肝組織中IFN-γ主要由聚集到肝內(nèi)的T細胞分泌，TNF-α則主要由KCs分泌。肝外這兩個因子則主要由T細胞分泌。本研究結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，Con A對照組血清和肝 組 織TNF-α和IFN-γ水平均顯著升高(P均<0.05)，生理鹽水對照組血清和肝組織中IFN-γ，血清TNF-α水平均未見明顯改變，肝組織TNF-α水平顯著下降(P<0.05)。與Con A對照組相比，Con A敲除組肝 組 織中IFN-γ和血清中TNF-α均顯著升高(P均<0.05)，而肝 組 織TNF-α和血清IFN-γ水平無明顯改變，提示CD11c+細胞中TAK1的敲除影響了這兩種因子的分泌。肝 組 織中IFN-γ表達增加，血清中則無明顯改變，說明TAK1的敲除可促進已經(jīng)聚集在肝中的T細胞分泌IFN-γ，而對肝外的T細胞分泌IFN-γ則無直接影響。和Con A對照組相比，Con A敲除組中TNF-α在血清中顯著升高，但在肝勻漿中卻無明顯改變，而與生理鹽水對照組相比，肝中TNF-α分泌明顯降低，提示CD11c+細胞中TAK1的敲除可能抑制了肝中KCs分泌TNF-α。這些均提示CD11+細胞中的TAK1敲除可以抑制KCs分泌TNF-α，促進肝中聚集的T細胞分泌IFN-γ，進一步加重炎癥反應(yīng)。

Th1型細胞主要分泌TNF-α、IFN-γ和IL-2等細胞因子，Th2型細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等細胞因子。IL-4主要由T細胞分泌，可以刺激單核、肥大細胞等增殖，增強抗原呈遞功能，刺激NK細胞等分泌IFN-γ。本研究中，和Con A對照組相比，Con A敲除組血清中該因子表達顯著升高，說明TAK1的敲除可以刺激T細胞分泌IL-4，加重炎癥反應(yīng)。IL-6是一種主要由Th2型細胞、巨噬細胞、甲狀腺細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的炎癥因子，具有抗感染，促進B細胞分泌抗體等多種生物活性作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD11c+細胞TAK1的敲除可以明顯促使血清中IL-6分泌增加。IL-5也在急性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，有研究表明，IL-5的敲除可以明顯加重血液、脾和骨髓中嗜酸性粒細胞的浸潤，延長該細胞的壽命[21]。而本研究中可以看到鼠尾靜脈注射Con A的小鼠其IL-5分泌明顯增加，但Con A敲除組和Con A對照組間無明顯差異，說明Con A可以促進肝中嗜酸性粒細胞的浸潤，但CD11c+細胞中TAK1的敲除不會影響IL-5的分泌，即不會影響機體嗜酸性粒細胞的增殖和分化。

IL-12主要由單核巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原提呈細胞以及B細胞分泌。中性粒細胞和Th細胞也可分泌該因子。而該因子可以有效刺激NKT細胞和NK細胞的活性，促進Th1細胞的發(fā)育，誘導多種細胞因子產(chǎn)生，從而加重炎癥[22]。而本研究結(jié)果顯示，經(jīng)鼠尾靜脈注射Con A之后，Con A對照組和Con A敲除組之間無明顯差異，說明CD11c+細胞TAK1的敲除不會影響IL-12分泌。而其具體機制尚需進一步探討。

綜上所述，CD11c+細胞中TAK1的敲除可以促進Con A誘導的肝損傷中肝細胞的壞死，加重肝組織損傷，抑制KCs中TNF-α的分泌，但不影響DCs等細胞分泌的IL-12，不影響嗜酸性粒細胞的增殖和分化。同時CD11c+細胞中TAK1的敲除可以促進該損傷中部分Th1和Th2型細胞因子的分泌，提示CD11c+細胞中TAK1的功能可能為維持肝中的免疫穩(wěn)態(tài)。當CD11c+細胞中TAK1被敲除時，可加重Con A誘導的免疫性肝損傷。

[1]HEYMANN F，HAMESCH K，WEISKIRCHEN R，et al.The concanavalin A model of acute hepatitis in mice[J].Lab Anim，2015，49(Sup1)：12-20.

[2]LEISTM，WENDEL A.A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A[J].J Hepatol，1996，25(6)：948-959.

[3]KNOLLE P A，GERKEN G，LOSER E，et al.Role of sinusoidal endothelial cells of the liver in concanavalin A-induced hepatic injury in mice[J].Hepatology，1996，24(4)：824-829.

[4]TIEGS G，HENTSCHELJ，WENDEL A.A Tcell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A[J].J Clin Invest，1992，90(1)：196-203.

[5]BALLERSTADTR，EVANSC，MCNICHOLS R，et al.Concanavalin A for in vivo glucose sensing：a biotoxicity review[J].Biosens Bioelectron，2006，22(2)：275-284.

[6]WANG H X，LIUM，WENG SY，et al.Immune mechanisms of concanavalin A model of autoimmune hepatitis[J].WorldJGastroenterol，2012，18(2)：119-125.

[7]DAVID B A，REZENDE RM，ANTUNESMM，et al.Combination of mass cytometry and imaging analysis reveals origin，location，and functional repopulation of liver myeloid cells in mice[J].Gastroenterology，2016，151(6)：1176-1191.

[8]FECHTNER S，F(xiàn)OX D A，AHMEDS.Transforming growth factor beta activated kinase1：a potential therapeutic target for rheumatic diseases[J].Rheumatology(Oxford)，2017，56(7)：1060-1068.

[9]ROHY S，SONGJ，SEKI E.TAK1regulates hepatic cell survival and carcinogenesis[J].J Gastroenterol，2014，49(2)：185-194.

[10]IKEDAY，MORIOKA S，MATSUMOTO K，et al.TAK1 binding protein2is essential for liver protection from stressors[J].PLoSOne，2014，9(2)：e88037.

[11]MORIOKA S，SAI K，OMORI E，et al.TAK1regulates hepatic lipid homeostasis through SREBP[J].Oncogene，2016，35(29)：3829-3838.

[12]SONGIJ，YANGYM，INOKUCHI-SHIMIZU S，et al.The contribution of toll-likereceptor signaling to the development of liver fibrosis and cancer in hepatocyte-specific TAK1-deleted mice[J].IntJCancer，2018，142(1)：81-91.

[13]PANY，LEI Z，WEI X，et al.TAK1deficiency in dendritic cells inhibits adaptive immunity in SRBC-immunized C57BL/6 mice[J].FEBSOpen Biol，2016，6(6)：548-557.

[14]劉應(yīng)莉.骨髓間充質(zhì)干細胞治療小鼠自身免疫性肝炎的實驗研究[D].天津：天津醫(yī)科大學，2012.

[15]ROTH R A，CASSELL DJ，MADDUX B A，et al.Regulation of insulin receptor kinase activity by insulin mimickers and an insulin antagonist[J].Biochem Biophys Res Commun，1983，115(1)：245-252.

[16]WANGY，HUANG G，VOGEL P，et al.Transforming growth factor beta-activated kinase1(TAK1)-dependent checkpoint in the survival of dendritic cells promotes immune homeostasis and function[J].Proc Natl AcaDSci U S A，2012，109(6)：343-E352.

[17]TOMIYAMA C，WATANABE H，IZUTSUY，et al.Suppressiverole o f hepatic dendritic cells in concanavalin A-induced hepatitis[J].Clin ExpImmunol，2011，166(2)：258-268.

[18]WANGJ， CAOX， ZHAOJ， et al.Critical roles of conventional dendritic cells in promoting Tcell-dependent hepatitis through regulating natural killer Tcells[J].Clin Exp Immunol，2017，188(1)：127-137.

[19]楊敬寧，趙杰.漿細胞樣樹突狀細胞與免疫耐受[J].國際免疫學雜志，2012，35(4)：273-276.

[20]陳旭央，張冰，胡莉蔓.IL-17、IL-5、IL-4、IL-33等細胞因子在哮喘發(fā)病機制中的作用[J].中國醫(yī)藥導報，2015，12(14)：98-101.

[21]HAMELMANN E，GELFAND EW.Role of IL-5in the development of allergen-induced airway hyperresponsiveness[J].Int Arch Allergy Immunol，1999，120(1)：8-16.

[22]趙桐，楊安鋼，溫偉紅.IL-12用于腫瘤基因治療的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志，2015，31 (10)：1424-1428.