劉丹，焦良波，張文，王心怡，陳濤，胡衛(wèi)，*

（1．三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理/腫瘤科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌443002；2．三峽大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，湖北宜昌443002；3．宜昌市第二人民醫(yī)院，湖北宜昌443002）

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來各種療法層出不窮，但由于肝癌的高轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，其5年生存率極低[1]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)學(xué)說認(rèn)為 ， CSCs是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥性的關(guān)鍵所在[2-3]。因此，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療有望成為根除肝癌的有效治療方法之一。近年來中醫(yī)藥以其獨(dú)特的辨證論治理論和“治未病”的防治特點(diǎn)，在控制腫瘤轉(zhuǎn)移方面已凸顯其優(yōu)勢(shì)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥QHF復(fù)方能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并能明顯抑制肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[5]，但對(duì)于QHF復(fù)方抑制肝癌細(xì)胞生長的機(jī)制尚不清楚，故本實(shí)驗(yàn)將在細(xì)胞水平上探討QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞生長、凋亡、侵襲及肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的影響，以期為探討QHF復(fù)方防治肝癌提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人肝癌Huh7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。華蟾素注射液購自安徽金蟾生化股份有限公司；人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)品和胰蛋白酶均購自上海源葉生物科技有限公司；香菇多糖購自南京澤朗植提技術(shù)有限公司；注射用血塞通(凍干)購自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 QHF復(fù)方配制參考文獻(xiàn)[5]，將華蟾素、人參皂苷Rg3、三七總皂苷、香菇多糖按一定的比例進(jìn)行配制。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分為溶劑對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基)、陽性對(duì)照組[加入2.5μg/mL順鉑(DDP，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制)]和QHF復(fù)方處理的實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入不同濃度(20、40、80、160、320μg/mL，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制)的QHF復(fù)方懸液100μL，培養(yǎng)24、48、72h，藥物作用終止前4h，于每孔中各加入5 mg/mLMTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，搖床上振蕩10min，使紫色結(jié)晶充分溶解。于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔 光 密度D(570)值。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率=[溶劑對(duì)照組 D (570)值-實(shí)驗(yàn)組 D (570)值]/[溶劑對(duì)照組 D(570)值-空白組 D(570)值]×100%

1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)溶劑對(duì)照組與陽性對(duì)照組給藥方法同前，實(shí)驗(yàn)組選用QHF 復(fù)方的80μg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取饑餓4h的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用含0.2%胎牛血清蛋白(BSA)的無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取100 μL(7×104/mL)細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中，各組加藥100μL。下室中加入600μL含10%B S A的DMEM高糖培養(yǎng)基，24h后，吸棄小室內(nèi)的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去膜內(nèi)表面的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定1h，結(jié)晶紫染色30min，清水沖洗，揭下濾膜，放在載玻片上于200倍光鏡下觀察濾膜外的細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量同1.2.3。取生長相近并處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，PBS洗滌并用冰乙醇固定后用預(yù)冷的PBS漂洗離心，使用10μL RNA酶(10g/L)處理后，加入熒光染料溴化丙錠溶液490μL，避光染色30min，300目尼龍膜過濾后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞分組及前期處理同1.2.4，各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，加入100μL結(jié)合緩沖液和FITC標(biāo)記的Annexin-V(20μg/mL)10μL，室溫避光30 min，再加入PI(50μg/mL)5μL，避光反應(yīng)5min后，加入400μL結(jié)合緩沖液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6 細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133和CD44的檢測(cè)細(xì)胞分組及前期處理同1.2.4，各組細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，80μL PBS懸浮，加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗體10μL，室溫暗處孵育30min。加FcR阻斷劑20μL，緩沖液80μL，充分混合后避光，4℃放置10min，PBS洗滌，重懸，離心去上清，加500μL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)分析細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133和CD44的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次， 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。以α =0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞增殖的影響

與DDP組比較，不同濃度(20、40、80、160和320 μg/mL)QHF復(fù)方在各時(shí)間點(diǎn)均能抑制Huh7細(xì)胞增殖，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，但抑制作用均低于DDP組(P均<0.05)。見表1。根據(jù)QHF復(fù)方對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，且在QHF為 8 0μg/mL時(shí)，作用效率更強(qiáng)，故選用QHF復(fù)方的80 μg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 QHF 復(fù) 方對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞增殖抑制率的影響(%，-x±s)

2.2 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞侵襲的影響

80μg/mL QHF組和DDP組(陽性對(duì)照組)穿透濾膜進(jìn)入下室的Huh7細(xì)胞數(shù)目均低于溶劑對(duì)照組，且QHF組細(xì)胞數(shù)目低于DDP組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 QHF 復(fù) 方對(duì)人肝癌 H uh7細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞周期的影響

與溶劑對(duì)照組比較，陽性對(duì)照DDP組和80μg/mL QHF組G0/G1期的細(xì)胞比例均減少，S期的比例均增加，DDP組G2/M期的細(xì)胞比例明顯增多而QHF組G2/M期的比例減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見 圖 2 和表2。

圖2 QHF復(fù)方對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞周期的影響

表2 QHF復(fù)方對(duì)人肝癌細(xì)胞系 H uh7細(xì)胞周期的影響(%，-x±s)

2.4 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞凋亡的影響

與溶劑對(duì)照組比較，QHF組和DDP組凋亡細(xì)胞比例明顯增高，且QHF組細(xì)胞凋亡比例明顯高于DDP組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3和表3。

2.5 QHF復(fù)方對(duì)Huh7細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133和CD44表達(dá)的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見表 3，QHF組表達(dá)CD133+和CD44+細(xì)胞比例較溶劑對(duì)照組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽性對(duì)照DDP組表達(dá)CD133+和CD44+細(xì)胞比例與溶劑對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 QHF復(fù)方對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞凋亡的影響

表3 QH-F 復(fù) 方對(duì)人肝癌細(xì)胞系 H uh7 細(xì) 胞凋亡率和 C D133、 C D44表達(dá)的影響(x± s)

3 討論

CSCs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和放化療抗性中發(fā)揮著十分重要的作用。Reya等[6]提出的“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說”認(rèn)為：在腫瘤組織中存在一種數(shù)量較少的干細(xì)胞樣癌細(xì)胞亞群，具有癌細(xì)胞和干細(xì)胞的特性，是腫瘤形成的起始細(xì)胞，在腫瘤形成、生長和轉(zhuǎn)移中起決定作用，這種細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞。隨后的研究表明肝癌中也存在肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells，LCSCs)，而且肝癌的高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移性與LCSCs有關(guān)[7-8]。目前發(fā)現(xiàn)CSCs表面標(biāo)記物有CD133、CD24、CD44、CD166和EpCAM等，其中CD133、CD44是最常見的標(biāo)記物[9-10]。CD133是一種跨膜糖蛋白，是經(jīng)典的CSCs標(biāo)志分子，表達(dá)CD133+的肝細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征：即高克隆性、成瘤性及對(duì)放化療的抗性[11]。另有研究顯示，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后不良與CD133+細(xì)胞表達(dá)密切相關(guān)[12]。Song等[13]實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)CD133在肝癌治療中發(fā)揮核心作用。CD44是一種細(xì)胞表面蛋白，最先被認(rèn)為是淋巴細(xì)胞受體[14]，也是透明質(zhì)酸的主要表面受體[15]，不少研究結(jié)果顯示CD44能調(diào)節(jié)或加強(qiáng)抗凋亡蛋白作用而在CSCs中具有重要意義[16]。

課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)QHF復(fù)方能顯著提高肝癌H22荷瘤小鼠的生存期[17]，可抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲能力及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)[18]，但對(duì)于該復(fù)方是否是通過下調(diào)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)來發(fā)揮抗肝癌作用的尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)選用高表達(dá)CD133的人肝癌Huh7細(xì)胞[13，19]為研究對(duì)象，初步探討QHF復(fù)方對(duì)肝癌干細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，QHF復(fù)方能抑制人肝癌Huh7細(xì)胞的增殖、侵襲，使細(xì)胞周期阻滯在S期，并促進(jìn)Huh7細(xì)胞的凋亡，顯著下調(diào)肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133和CD44的表達(dá)，使CD133+和CD44+細(xì)胞比例明顯降低。這些結(jié)果提示QHF復(fù)方能夠影響人肝癌Huh7細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞的生長、侵襲，這種抑制作用可能是由于QHF復(fù)方對(duì)腫瘤干細(xì)胞具有抑制作用，但是也不排除腫瘤干細(xì)胞分化成了其他細(xì)胞，或者只是抑制了CD133和CD44的表達(dá)。因此，下一步擬分離出CD133+和CD44+肝癌干細(xì)胞，進(jìn)一步研究該復(fù)方對(duì)干細(xì)胞活性(如增殖、耐藥、體內(nèi)成瘤等方面)的影響，探究QHF復(fù)方可能的抗肝癌干細(xì)胞的作用機(jī)制。

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